戴晓虎教授团队：不同水热预处理方法对水稻秸秆组成结构及酶解特性的影响
研究背景
在我国，农作物秸秆作为一种来源丰富、分布广泛的可再生资源却尚未得到有效利用，大量秸秆通过填埋或直接焚烧的方式处理处置，带来了严重的环境污染和生物质资源的浪费。因此，促进秸秆的资源化利用是助力碳达峰和碳中和的重要举措，开发具有成本效益特征的秸秆生物质转化方式是当前研究的热点。
秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素 3 种组分之间通过不同化学键互作交联构成的一种结构极为复杂的生物质，也被称为木质纤维素。纤维素主要由葡萄糖单体通过糖苷键连接和氢键作用形成的聚合度较高的纤维管束构成，其表面被半纤维素和木质素紧紧包裹。半纤维素是一种由五碳糖和六碳糖组成的短链聚合物，其聚合度远低于纤维素。木质素是一种重要的芳香族聚合物，其交联率占木质纤维素生物质的30%，既是阻碍化学和生物途经获取糖的屏障，也是纤维素酶的抑制剂。其次，木质素、纤维素和半纤维素之间通过醚键和酯键形成的高度交联的三维网络结构，进一步阻碍了碳水化合物的资源化转化。由于木质纤维素结构复杂、性质稳定、生物降解性低，难以被微生物和酶直接利用，限制了其在能源利用和化工领域的应用。因此，在秸秆的资源化利用中，需要通过预处理来破坏秸秆复杂致密的结构，去除原料中的木质素和少量半纤维素，增加酶对纤维素的可及性，从而提高后续利用效率且降低生产成本。
水热预处理是木质纤维素资源化利用的常用预处理方法，其以高温、高压的水蒸气或液态水为介质，通过破坏木质纤维素的物质结构来提高降解性能。研究表明，水热预处理可以改变秸秆表面结构进而提高糖化程度，也会显著促进后续厌氧消化产甲烷性能。碱热预处理在脱木素、甲烷产生效率和底物转化率方面表现出明显的优势，而酸处理可以提高纤维素的回收率和生物乙醇的产率。可见，不同预处理方法显著影响秸秆的组成结构和后续利用。尽管先前的研究已将水热预处理应用于秸秆的处理处置，但不同预处理方法对秸秆的结构特征、化学组成和酶解特性的影响及其变化机制仍然缺乏认识。
本文以水稻秸秆为原料，探究水热、KOH、CH3COOH、HCl、FeCl2预处理方法对秸秆的表面理化性质、孔结构特征和化学组成的影响，进而解析不同预处理方法中木质纤维素酶解转化的特征及变化机制，研究结果为秸秆的处理处置和资源化利用提供参考。
摘 要
为探明不同水热预处理方法对秸秆结构特征、化学组成和酶解特性的影响及其机制，采用了纯水热、KOH、CH3COOH、HCl、FeCl2 5 种预处理方法对水稻秸秆进行预处理，从物料损失、化学组分、比表面积、孔隙结构、化学结构、表面粗糙度、粒径分布及酶解后糖浓度进行分析，阐明了变化特征和影响机制。结果表明：碱热预处理能通过酯键的断裂从而有效去除秸秆中的木质素，木质素回收率低至46.2%；而木质素的溶出造成了孔道坍塌，相对结晶度显著增加（38.9%），孔径和比表面积减小至9.24 nm和2.62 m2/g。酸处理均能促进半纤维素的溶解，使得秸秆中形成了更多的小孔和微孔。碱热预处理后，秸秆的粒径由0.334 mm降至0.141 mm，分形维数由1.92减至1.71，疏松的结构促进了酶解反应效率，总糖浓度达到39.9 g/L，且葡萄糖和木糖占比较大，而HCl组预处理后的葡萄糖含量最高。
01 实验部分
1. 实验原料与试剂
本研究使用的水稻秸秆来自江苏连云港，秸秆原料首先长度剪至厘米，经过清洗干燥后，通过球磨机（M20，IKA，Germany）研磨至1mm左右。原秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的质量分数分别为24.0%，16.3%和9.9%。然后将处理好的水稻秸秆用塑料袋密封放入干燥器内，以便后续水热预处理使用。本实验中所使用的化学药剂购买于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯级别。
2. 预处理
本研究采用5种不同的水热预处理方法对水稻秸秆进行预处理，通过参考先前文献报道确定具体实验组合及试剂用量，如表1所示。将秸秆与化学药剂按照相应比例混合，再以固液比1：10与250 mL超纯水混合均匀，然后放入无搅拌的300 mL高温水热反应釜内。将反应釜置于电热恒温鼓风干燥箱中缓慢升温至170 ℃，维持温度1 h后在室温自然冷却。预处理结束后，通过冷冻离心机（13000 r/min，25 min）进行固液分离，上清液部分经0.45 μm滤膜过滤后置于4 ℃冰箱密封保存以备后续检测分析。固体沉淀物使用超纯水冲洗至中性后，一部分置于60 ℃烘箱烘干至恒重进行酶解，剩余部分固体经过冷冻干燥以备后续结构与组成分析。
表1 水稻秸秆预处理实验方案
3. 酶 解
酶解所用的纤维素酶和木聚糖酶由索莱宝有限公司提供。称取预处理后的秸秆样品0.5 g于50 mL锥形瓶中，以1:20的固液比加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，同时加入指定酶量（纤维素酶300 IU/g，木聚糖酶150 IU/g），置于恒温摇床中反应。反应温度为50 ℃，摇床转速为150 r/min，酶解时间为72 h。酶解反应结束后，需在沸水浴中灭活10 min，然后样品经过冷冻离心（10000 r/min，10 min），收集上清液经0.45 μm滤膜过滤后置于4 ℃冰箱保存用于后续单糖组分分析。
4. 分析方法
物料损失率可由预处理前后秸秆经清洗烘干后的质量计算，各组分的回收率计算可参考先前文献。纤维素、半纤维素和木质素的含量测定可以参考文献。通过全自动比表面积分析仪（BET，ASAP2460，USA）解析预处理后秸秆比表面积变化和孔结构特征。采用傅里叶红外光谱仪（FTIR，Nicolet5700，USA）在4000~400 cm-1光谱区域、分辨率为4 cm-1的条件下，扫描32次，分析秸秆预处理后官能团差异。使用X射线衍射仪（XRD，UltimaIV，Japan）分析秸秆处理前后的相对结晶度变化，扫描范围设置5~90 °，扫描速度为2 °/min，扫描步长为0.02 °。通过接触角仪（OCA20，DataPhysics，Germany）和原子力显微镜（AFM，Nanoscope V Multimode8，Germany）分析预处理后秸秆接触角和表面粗糙度的差异。采用马尔文激光粒度仪（Mastersizer 2000E，UK）分析预处理后水稻秸秆的粒径分布和分形维数。利用高效液相色谱法（Agilent 1210，USA）测定酶解液中单糖浓度，色谱柱为UPLC T3，进样量为10 μL，流速为0.6 mL/min，流动相为5 mmol/L硫酸，柱温为65 ℃。
02 结果与讨论
1. 物料损失和化学组分变化
物料损失一定程度反应了固体中化学组分的溶出。水稻秸秆在不同水热预处理方法后物料损失、水解液的pH值变化以及化学组分如图1所示。可知：水热-HCl预处理后物料损失达到40.5%，同时纤维素和半纤维素的回收率在所有实验组中最低，为68.8%和24.2%。在酸预处理过程中，H+既能催化纤维素内部的2个脱氢葡萄糖单元之间的糖苷键裂解，也会促进半纤维素乙酰基团的脱落，从而加速了秸秆组分中纤维素和半纤维素的去除。而有机酸的催化就显得比较温和，水热-CH3COOH预处理后半纤维素的回收率（74.3%）远高于水热-HCl组。在碱热预处理过程中，物料损失与纯水热预处理接近，但木质素的回收率低至46.2%，表明碱热预处理更有利于木质素的去除。结果表明，在酸性、碱性预处理条件下，纤维素和半纤维素的回收率相较于水热组都出现了降低，而木质素受影响较小。特别是半纤维素由于分支存在许多侧链，受热不稳定，极易分解。而木质素单体的共轭酚类性质使它们在酸性和碱性介质中都容易发生缩合反应重新沉积在秸秆表面，阻碍了进一步的溶出和去除。
图1 不同预处理方法后水稻秸秆的物料损失、水解液pH值变化及化学组分回收率
2. 不同预处理方法对比表面积和孔结构的影响
水稻秸秆在经过水热预处理后，其比表面积和孔隙结构的变化会直接影响酶与底物反应的接触面积，从而改变催化效率。不同水热预处理后秸秆的比表面积、孔径和孔容特征如表2所示。可知：经过预处理的秸秆比表面积均低于未处理组，而平均孔径都高于未处理组。除水热-FeCl2组外，酸碱预处理组的秸秆比表面积和平均孔径均小于纯水热预处理。当引入酸碱化学试剂进行水热预处理时，秸秆表面屏障被进一步破坏，纤维素、半纤维素和木质素等化学组分出现不同程度的溶出，造成了部分孔道坍塌、比表面积减小。然而，不同化学组分的溶出对孔结构造成的影响也存在差异。碱热预处理组的平均孔径和总孔容均低于纯水热组，说明更多木质素的溶出造成秸秆内部结构的严重坍塌。而酸处理能促进半纤维素的溶出，使得秸秆内部形成了更多的小孔和微孔，所以孔径减小的同时孔容却高于碱热预处理组。
表2 不同预处理方法水稻秸秆的BET分析
3. 不同预处理方法对化学结构的影响
FTIR光谱图能够定性的分析预处理后秸秆表面官能团的变化，分析结果如图2a所示。可知：不同水热预处理后波谱趋势大致相同，但是特征峰的吸收强度发生了明显变化。波长3420 cm-1和2920 cm-1处的吸收峰分别由—OH和甲基、亚甲基上的C—H伸缩振动产生，其中木质素中的羟基主要以脂肪族羟基和酚羟基的形式存在，且脂肪族羟基基团占主导地位。1715 cm-1的吸收峰对应于半纤维素中的乙酰基和木质素与碳水化合物连接酯键的非共轭羰基伸缩振动。碱热预处理组和FeCl2组在1715 cm-1的吸收峰明显减弱或消失，这表明与半纤维素连接的乙酰基和木质素因为酯键的断裂而脱除。波长1650，1515，1420 cm-1处的吸收峰是由木质素的共轭羰基拉伸振动产生，属于木质素的特征峰。相比纯水热组，酸处理组和FeCl2组在该处的特征峰有所增强，主要由于预处理过程中半纤维素损失较多，导致木质素的相对含量升高；而碱热预处理组的吸收峰有所降低，说明秸秆中大量的木质素被去除。这也与2.1节中的化学组分分析结果相一致，酯键的断裂和脱除可能是碱热预处理去除木质素的重要原因。此外，在碱热组中，由Si—O变形振动在460 cm-1处产生的吸收峰强度明显低于其他实验组，这也表明碱热预处理破坏了秸秆硅质层，促进了秸秆内部硅酸盐的溶出。
图2 不同预处理方法对水稻化学结构的影响
不同预处理后水稻秸秆的XRD图谱和相对结晶度如图2b，c所示。可知：秸秆预处理前后XRD衍射峰主要分布在16 °、22 °和26 °左右的低角度区域。Anupama等研究表明，分布于101，021，002和040晶格的14.8 °、16.7 °、20.7 °、22.5 °和34.6 °处的衍射峰为纤维素的特征峰，在本研究中进一步得到了验证。纯水热预处理后，相对结晶度由36.9%减小至36.0%，结晶度变化不大表明纯水热处理对结晶纤维的影响较小。碱热预处理后，相对结晶度显著增加，增至38.9%，表明秸秆在碱性水热环境中木质素及非晶物质被大量去除，化学组分的溶解使得更多的结晶纤维暴露出来，导致相对结晶度增加。除水热-HCl组外，其他两组（CH3COOH和FeCl2）酸性条件下的结晶度有所降低，这可能和纤维素的部分降解以及木质素等非晶物质的再缩聚有关。而HCl组在损失纤维素的同时，更多的半纤维素被溶解，使得内部的结晶纤维暴露程度相对更高，所以与其他两组酸性环境相比，相对结晶度有所增加。
4. 不同预处理方法对接触角和粗糙度的影响
水稻秸秆经过不同的水热预处理后，化学组分的溶出使得表面形貌特征也发生了变化。不同预处理组秸秆表面接触角和粗糙度的变化如图3所示。未经处理的秸秆，表面较为光滑，硅质层凸起分布均匀，表面粗糙度仅为0.521 nm。而大部分预处理后，秸秆表面受到了不同程度的破坏，粗糙度变大，这也有利于后续利用。未处理的秸秆表面接触角为90.5 °，表现出强疏水性。水稻秸秆的表面湿润性不仅与非极性提取物的存在有关，还与表层覆盖的蜡质层以及表面的多孔性相关。不同水热预处理后，所有组的接触角都降低，表明水热过程破坏了表面的蜡质层，使得秸秆的亲水性增强。其中，CH3COOH组的表面接触角最低（降至65.5 °），表面粗糙度也增至1.950 nm，说明经预处理后秸秆的亲水性和粗糙度较高。由于木质素、硅酸盐在酸性条件下更容易沉积在秸秆表面，进而造成表面粗糙度的增加；而在碱性条件下其更易溶解，所以秸秆在碱热预处理后的粗糙度明显低于酸处理实验组。
图3 不同预处理方法后水稻秸秆表面接触角和粗糙度变化
5. 不同预处理方法对秸秆粒径的影响
水稻秸秆预处理后的粒径对后续的厌氧消化过程产甲烷性能有显著影响，粒径减小可以显著提高甲烷产量。秸秆经过不同预处理后粒径分布和分形维数如图4所示。可知：纯水热组（平均径0.329 mm）预处理后粒径分布与未处理组（平均径0.334 mm）相差不大，而引入化学药剂的其他实验组粒径分布曲线明显向左移动，这表明仅进行水热预处理对秸秆粒径的影响是有限的，而酸碱预处理可以显著地降低秸秆粒径。分形维数可以用来表征颗粒或团聚物内部结构的紧密程度，一般来说，分形维数越高，内部结构越密实紧凑，反之结构越疏松。松散的结构有利于物质的传质，酶分子的活动和催化作用也会进一步增强。显然，碱热预处理后不仅秸秆粒径降低（0.141 mm），分形维数也显著下降（由1.92降至1.71）。这表明，碱热预处理后秸秆表面及内部结构破坏程度更高，整体结构也变得更加松散，有利于后续资源化利用。可能由于碱性环境木质素被去除的同时，SiO2也被大量溶解。而酸处理仅对半纤维素有较大的影响，因此粒径和分形维数略高于热碱处理。
图4 不同预处理方法对水稻秸秆粒径和分形维数的影响
6. 不同预处理方法对秸秆酶解影响
采用纤维素酶和木聚糖酶对不同水热预处理后的水稻秸秆进行酶水解实验，并检测反应后单糖组分的浓度，结果如图5所示。可知：未经处理组和纯水热预处理实验组的酶解效率都处于较低水平，总糖浓度分别为13.1，20.9 g/L，而碱热预处理后酶水解总糖浓度在所有实验组中最高，达到39.9 g/L。从整理来看，酸碱水热预处理方法普遍能提高酶水解后葡萄糖浓度。HCl组预处理后的酶解葡萄糖含量最高，达到24.5 g/L，是未处理组的1.99 倍，纯水热组的1.18 倍。碱热预处理后的酶解糖分主要源于葡萄糖（23.1 g/L）和木糖（15.5 g/L），而阿拉伯糖浓度（0.58 g/L）也远高于其他实验组合。同时，观察到木糖在酸处理2个实验组（HCl组和CH3COOH组）中大量损失，而FeCl2组木糖含量相比其他酸预处理组有相当程度的保留（7.65 g/L）。各组水热预处理酶解后阿拉伯糖的含量均处于较低水平甚至未检出。在本研究中，碱热预处理后酶水解总糖浓度最高，主要因为木糖、阿拉伯糖的损失较小，也表明较多的半纤维素被保留在了固相中。此外，2.5节分析中热碱预处理后的秸秆具有更低的分形维数和较小的粒径，松散的结构可能更有利于提高酶解反应的效率，促进了酶与底物的可及性。
图5 不同预处理方法后酶解糖浓度变化
03 结 论
1）不同水热预处理方法能不同程度的去除纤维素、半纤维和木质素。碱热预处理能够有效去除木质素，而酸处理对半纤维素的溶出影响更大。
2）碱热预处理后木质素的溶出造成了秸秆内部结构的严重坍塌，而酸处理中半纤维素的溶出则是在秸秆中形成了更多的小孔隙。
3）碱热预处理后酯键的断裂和脱除是木质素去除的重要原因，秸秆粒径降低、结构疏松提高了酶解反应效率，促进了酶与底物的可及性。
4）碱热预处理后酶水解总糖浓度达到39.9 g/L，主要源于葡萄糖和木糖，且阿拉伯糖浓度也远高于其他组合，而HCl组预处理后的葡萄糖含量最高。
戴晓虎 教授
同济大学环境科学与工程学院教授，博士生导师，2009年入选海外高层次人才引进计划全职回国工作，长期致力于污水污泥及有机固废污染控制与资源化理论与技术研究。曾任第七届教育部科技委环境与土木水利学部副主任、国务院学术委员会第七、八届学科评议组成员、国家自然科学基金委工程材料学部第六届专家咨询委员会委员、国家“863计划”资源环境技术领域污染控制技术主题专家组组长、国家水体污染控制与治理科技重大专项总体专家组成员、“十三五”重点研发计划“固废资源化”重点专项实施方案编制专家组共同召集人、“十四五”重点研发计划“循环经济关键技术与装备”重点专项总体专家组副组长、国际水协（IWA）Fellow等。荣获全国创新争先奖、中国工程院光华工程科技奖、国家教学成果二等奖、上海市技术发明奖一等奖、环境保护科学技术奖一等奖、IWA项目创新奖（PIA）银奖、日内瓦国际发明展金奖等奖励，成果入选中国生态环境十大科技进展。
