化感物质抑制藻类过度繁殖的机理及效能研究进展
导读：水体富营养化是近年来我国部分水体面临的关键水质问题，大量繁殖的藻类能够合成和释放生物活性化合物和藻毒素等不同类别的次级代谢产物，对饮用水水质安全和水环境质量产生负面影响。此外，在全球气候变暖的影响下，浮游藻类将HCO3-、CO3-等高效无机碳转化为藻类生物量，蓝藻产生的有机碳进一步矿化为CH4和CO2。在富营养化成为普遍的环境问题大背景下，控制藻类的过度繁殖成为人们关注的热点环境问题之一。目前发现的导致湖泊水华的主要藻种包括蓝藻、绿藻、硅藻、隐藻、裸藻、甲藻等(其所包含的具体种属及其生理特性如表1所示)，我国富营养化严重的淡水湖泊中优势藻类为微囊藻属和鱼腥藻属(蓝藻门)，且存在季节性的藻种更替现象。过高含量的藻类细胞对水体的使用价值产生较明显的负面影响，需要进行适当的处理。结合实际处理需求，多种处理方法被用于水中藻类的去除和控制，比较典型的方法包括物理处理法(如超声波、紫外线照射)、化学方法(如强化混凝和絮凝、化学除藻剂)和生物控制法(如水生植物、溶藻细菌、真菌和原生动物)等。上述方法在实际应用中取得了较明显的去除效果，但也存在实用性、抑藻效果等方面的问题：超声控藻方法简单，但若参数不合理,将对浮游动物捕食者造成损伤，声强过高对生物造成不可逆的触变效应；紫外处理具有低成本、无污染的优点，但会导致后端藻细胞在可见光下“复活”；混凝剂及人工合成药剂的投加虽然成本低廉、能应对紧急水华，但会对水处理造成二次污染，且对生态系统造成严重副作用；微生物抑藻过程中微生物具有极大的不稳定性，且受水力等自然因素影响较大。植物化感物质易发生光降解和氧化反应，但因其具有环境友好的特性，可以通过固定化或联用手段予以改进。
表1 常见水华藻类及其生理特性
化感作用一词最早是在1937年由Hans Molisch出版的一本描述植物之间相互影响的书中提出。从旧有角度看，化感作用可以被定义为植物之间由次生代谢物介导的负相互作用。1996年，国际化感作用学会定义的概念中考虑了更为复杂的相互作用，包括由次级代谢物介导的植物群体或微生物间的负、正相互作用，这些次生代谢物被称为化感物质。植物向环境释放化感物质的主要途径是从植物叶、根、枝中渗出，对于细菌、藻类、真菌等微生物而言，扩散是最常见的释放机制。自然水生生态系统中藻类和大型植物之间存在着明显的拮抗关系，一般认为是植物对营养物质和光照的竞争抑制了藻类的生长。1949年Hasler和Jones报道了水生植物的存在会导致湖泊浮游植物密度的降低；Nakai等提取并鉴定了穗状狐尾藻分泌的化感物质，纯化出焦性没食子酸(PA)、没食子酸(GA)、(+)-儿茶素(CATECH)和鞣花酸(EA)，并发现PA和GA比CATECH和EA对铜绿微囊藻具有更强的抑制作用；近期研究结果表明，芦苇分泌的2-甲基乙酰乙酸乙酯(EMA)、菖蒲分泌的木犀草素等黄酮类化合物、大麦秸秆分泌的Salcolin A和Salcolin B、狐尾草和水兰类植物释放的2-乙基-3-甲基马来酰亚胺等化感物质均可以较好地抑制藻类过度生长。
利用化感物质抑制藻类过度繁殖与生长具有绿色、环保的特点，近年来备受关注。本文针对化感物质对水华藻种的抑制作用，在总结化感物质抑藻研究现状基础上，重点阐明化感物质的典型种类、作用效能及机理，结合实际藻类控制需求，分析了化感物质除藻现有研究存在的不足，并对后续研究趋势进行了展望。
一、化感物质抑藻的效能及机理
1.1化感物质的种类
化感物质是生物体分泌的次生代谢物，主要有萜类、生物碱类、苯丙类及其衍生物三大类，具有特异性毒性、杀菌活性或胁迫性。萜类化感物质指的是一类烃及其含氧衍生物(醇、醛、羧酸和酯等)的总称，由异戊二烯或异戊烷以不同方式连接而成，在植物体中多以挥发油的形式存在，其中含氧单萜和倍半萜表现出较好的生物抑制活性；生物碱类化感物质是主要由植物分泌的含氮有机化合物，大部分为碱性，少数呈中性或酸性，具有较强的生理活性，包括异喹啉类、喹啉类、吲哚类等物质；苯丙类及其衍生物泛指含有一个或几个C6-C3单位的天然成分，包括简单苯丙素类、香豆素类、黄酮类等物质，涵盖了多数天然芳香族化合物，且大都具有酚酸性质。
根据不同种类化感物质的结构和性质，可分为：(1)水溶性有机酸、直链醇、脂肪醛和酮；(2)简单不饱和内酯；(3)长链脂肪酸和聚乙炔；(4)奎宁(苯醌、蒽醌和络合奎宁)；(5)简单酚类物质；(6)肉桂酸及其衍生物；(7)香豆素类；(8)黄酮类化合物；(9)单宁。主要化感物质的生物合成途径如图1所示。
图1 主要化感物质的生物合成途径
1.2化感物质对藻类的控（抑）制效能
通常用半抑制浓度(IC50)或细胞光密度来表征藻细胞的整体去除情况。根据化感物质种类及其结构的不同，抑藻效能也存在一定的差别。萜类化感物质的抑藻效应近年来才得到关注，萜内酯、青蒿素等萜类物质在经过7 d处理后能达到较好的抑藻效果；抑藻效能较好的生物碱类物质主要有小檗碱、禾草碱、血根碱、白屈菜红碱等，血根碱的抑藻率(IR)能达到90%，藻类细胞几乎完全被破坏，小檗碱对铜绿微囊藻的最大IR高于脂肪酸和脂类、酚酸等化感物质，平均控藻时间更短；目前已被证实抑藻效果较好的苯丙类物质有黄酮、木犀草素、5,4′-DHF、芹菜素、亚油酸、胡桃酮等，IR均在90%以上。其中，酚类化合物是生态系统中最常见、同时也是最重要的一类植物化感物质，由羟基(-OH)直接键合到芳香烃基团组成，对水华藻类的化感抑制效果具有广谱性，且多酚与脂肪酸联合投加的效果优于单独投加某种化感物质。
以湖泊蓝藻水华最常见的藻种(铜绿微囊藻)为处理目标，不同种类典型化感物质抑藻所需剂量及其效率如表2所示。
1.3化感物质抑藻机理
已有研究结果表明，化感物质主要通过改变浮游植物的生理过程来抑制或影响微生物的生长和繁殖，如细胞分裂、钾钙磷等离子和水的吸收、呼吸、光合作用、酶的功能以及信号转导。但具体途径因化感物质和微生物的种类有一定的差别，化感物质抑制水华蓝藻的作用途径及机理主要有几个方面。
1.3.1 干扰目标藻类的光合作用
光合作用是蓝藻最重要的生理过程之一，也是能量代谢的主要方式。藻类的光合作用通过位于类囊体膜上的蛋白质复合物PSⅡ(光系统Ⅱ)和PSⅠ(光系统Ⅰ)将太阳能转化为化学能,以维持细胞的生命活动。不同种类的化感物质对藻细胞的光合作用过程都有一定的影响，且化感物质已被证明对不同藻种的光合作用过程具有攻击性，破坏光合作用过程所需的必要物质和生产途径。也有研究表明，绿藻门小球藻属的光合系统对化感物质更为敏感。化感物质主要通过以下几种途径破坏光合系统从而影响藻类生长。
(1)降低光系统最大电子传输速率(rETRmax)和有效量子产率
这是化感物质破坏光合系统正常工作的最主要途径，对不同种类的化感物质具有普适性。生物碱类物质2-(4-氯苯基)-4-(4-甲氧基苯基)喹唑啉(CMQ)已被证实在高质量浓度条件下(大于5 mg/L)能显著抑制非循环电子流，传递电子造成的能量耗散不升反降，电子传递速率受到抑制；小檗碱通过阻碍全链和PSⅡ光合电子传递过程，诱导产生大量活性氧以起到抑藻效用；电子传递链同时也是N-苯基-2-萘胺等酚酸类物质的作用靶点；在黄酮类化合物的作用下，PSⅡ中电子转运相关蛋白的数量和活性降低，光系统Ⅱ中心的电子传递被中断，光合色素获得的太阳能无法转化为化学能，无法为卡尔文循环中CO2的固定和同化提供同化动力，进一步抑制了整个光合过程。
表2 不同种类化感物质的抑藻所需剂量及效率
(2)抑制光系统PSI
psaB蛋白是PSI复合体反应的中心组分，负责翻译PSI光反应中心P700蛋白质复合体中的83 kD蛋白质次单元。少部分化感物质通过抑制光系统PSI以破坏藻细胞光合作用。木犀草素作用于铜绿微囊藻时会导致psbD1转录物丰度显著增加，而psaB转录大幅下调，该种黄酮类自然分泌物通过对PSI光系统造成不可逆转型破坏来抑制光合作用进程。
(3)破坏功能蛋白质
D1蛋白是PSⅡ的一个关键亚单位，由psbA基因编码。成熟D1蛋白的合成包括psbA的转录、翻译以及前体(preD1)向D1的转化。当光损伤率超过蛋白质修复速率，会表现出净光抑制，部分化感物质能够抑制D1蛋白的翻译来抑制PSⅡ的修复。如在邻苯三酚的胁迫下，psbA转录上调，现有D1蛋白不足以替代受损蛋白，正常光反应修复受阻，以此影响了整个光合作用过程。
研究表明，植物分泌的化感物质会刺激叶绿体编码基因rbcL的转录，rbcL编码叶绿体基质的主要可溶性蛋白核酮糖-1,5-双磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大亚基，rbcL基因表达的下调有助于提高碳同化的效率以抑制PSⅡ光系统。
(4)限制光合放氧
某些化感物质可以通过限制光合放氧来抑制藻细胞的光合能力。例如，在4 mg/L壬酸作用下，铜绿微囊藻的光合放氧速率降至对照组的66%。
在化感物质投入水平较低的情况下，作为对环境胁迫的适应性反应，蓝藻细胞光合作用系统中的光子转移和捕获能力得到一定的增强；只有高浓度化感物质会导致整个光系统的崩溃。
1.3.2 减弱藻细胞呼吸作用
呼吸作为物质和能量代谢的主要枢纽，为细胞初级代谢提供碳骨架和三磷酸腺苷(ATP)。部分化感物质对藻细胞的呼吸作用产生一定的负面影响：Chen等发现经60 mg/L硬脂酸(SA)处理后，微囊藻的暗呼吸速率(Rd)显著降低，呼吸作用受到抑制。呼吸作用的抑制阻断了碳水化合物合成和ATP再生等重要生理过程，并限制了生长和细胞分裂可用的能量来源。
1.3.3 破坏藻细胞膜系统
细胞膜完整性是影响藻类细胞正常生长代谢的重要因素，部分化感物质会通过破坏细胞膜的完整性来影响藻类的正常生长、代谢。酚酸类化合物(如ρ-香豆酸、香草酸等)进入细胞膜后会引起细胞膜去极化，缩小膜内外电势差，改变离子的流入和滞留。离子如钾和磷酸盐倾向于先浸出，溶液中电导率增加，进一步改变细胞膜通透性，随后DNA、RNA和其他胞内大分子有机物泄漏，对细胞膜造成不可逆转的破坏，最终导致目标藻种的解体，且这种抑藻途径在具有膜系统结构的藻细胞内均能发挥作用；部分化感物质作为一种环境压力，会增加藻细胞内的产氧量，胞内氧含量增加会影响其他活性氧化合物(H2O2、·OH、1O2)的形成，进而诱导脂质、蛋白质等细胞膜组成成分的氧化损伤，同时对DNA造成损伤。部分酚酸能够增加铜绿微囊藻中O2和丙二醛(MDA)的含量，同时recA、grpE基因表达下调，削弱DNA修复能力，fabZ基因表达下调，造成细胞膜通透性的特征性表达和胞内有机物的释放。大麦秸秆提取物手性黄酮木脂素Salcolin A可诱导蓝藻细胞内活性氧(ROS)水平的增加，并抑制酯酶活性，而Salcolin B可引起蓝藻细胞质的泄漏。
1.3.4 细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)
PCD是一种不可逆的、由基因控制的自杀机制，可维持细胞遗传稳定性。一般藻类PCD会有以下特征：(1)细胞核和细胞质起泡；(2)细胞器退化；(3)caspase或metacaspase的激活及基因表达；(4)DNA裂解；(5)细胞质改变，如磷脂酰丝氨酸(PS)外化。狐尾藻分泌的PA(一种多酚化感物质)会导致藻细胞内ROS升高，并观察到类核分裂、光合片层破裂、固缩形成、空泡化和DNA断裂等生化特征。ROS作为一种介质，导致caspase-3(-like)的激活，而caspase-3(-like)在细胞的凋亡中发挥着重要作用，可诱导藻细胞发生PCD。
1.3.5 抑制藻细胞吸收营养物质
氮和磷是藻类繁殖过程中的限制性营养物质：磷是限制光合作用器官工作的最主要因素，铜绿微囊藻对磷的吸收主要通过高亲和力磷酸结合蛋白(Pst)和碱性磷酸酶(Pho)这两种蛋白控制；而氮是限制光合生物初级生产的最重要的营养物质，蓝藻中的氮同化和代谢由转录因子NtcA介导，nirA和amt编码亚硝酸盐还原酶和铵渗透酶，在硝酸盐同化和铵吸收中起重要作用。研究显示多酚类化感物质会导致nirA、ntcA和amt表达下调，铜绿微囊藻的氮同化效率降低；pstA和phoU的转录水平下调，磷的同化过程也受到抑制。
化感物质通过以上一种或几种途径的组合控制水华藻的生理生化状态，以抑制光合进程各要素和抑制呼吸作用，阻断藻细胞能量代谢及碳氧平衡为核心，辅以细胞膜脂质过氧化导致细胞形态结构变皱缩、内容物流失；基因控制细胞整体崩坏并诱发产生程序性死亡；控制藻细胞营养物质的摄入，致使磷的吸收和氮同化效率降低，最终使藻细胞丧失活性，蓝藻大量繁殖得以控制。
二、化感物质用于控藻的应用形式及方法
植物化感物质的产生受多种因素的影响，如植物和藻类的种类、数量和生理状态,以及营养物浓度、光、温度和酸碱度等。而且大部分化感物质的化学性质不稳定，易发生光降解和氧化反应而失活。若局部水体中化感物质浓度过高会对局部区域内的其他动植物造成威胁。研究者们采用不同技术改进化感物质在抑藻除藻过程中存在的问题，目前常用的形式或方法有以下几类。
2.1化感物质微球固定缓释技术
微球化能够很好地解决因直接投加提纯化感物质造成的局部浓度过高的问题。目前，缓释微球制备最常用的方法有喷孔法、乳液交联法、喷雾干燥法、溶剂蒸发法和相分离法，制备所用原材料一般为环境友好型且能够在水体中缓释的大分子有机物，常用的有海藻酸钠、明胶、壳聚糖、聚乳酸等。Ni等通过研究发现，质量浓度为0.2 g/L的亚油酸微球处理4 d后，处于指数期的藻类生长受到明显抑制。有研究将两种材料结合使用，如海藻酸钠是天然的聚阴离子多糖，而壳聚糖是带有氨基的碱性多糖，两者结合可以提高包埋活性物质的包埋率和缓释效率。化感缓释微囊解决了投加药剂时局部水体浓度过大带来了毒性的问题，实现了化感物质释放的连续性，但缓释药在实际湖泊等生态环境中使用时，仍存在扩散距离不同所带来的浓度梯度问题。因此，在此基础上可以适当辅以水力紊流措施，以达到浓度均匀的目的，抑藻效果更加理想。
2.2化感物质组合使用
单独使用一种化感物质时，抑藻效果有限，将两种或两种以上合适的化感物质按一定比例混合使用时，能取得更好的抑制效果。Zuo等研究了香豆素、对羟基苯甲酸、原儿茶酸、SA、对氨基苯磺酸这5种化感物质单独作用、分别组合时的除藻效能，结果表明2种或3种化感物质的混合物在未被污染水体中具有协同作用，4种或5种化感物质混合物的化感作用表现出拮抗作用。何宗祥等报道，PA和亚麻酸这两种化感物质的联合抑藻依赖于它们在组合中各自的百分比。因此，不同化感物质的相互作用和化感效应可能取决于化感物质的类型、比例、总浓度和目标藻种，具有相当大的不确定性，当探索出一种抑藻效果较好的化感物质搭配后，可将其作为高效抑藻剂投入使用。
三、化感物质抑藻的应用实例及实际可行性分析
目前，对于化感物质抑藻的研究和科研结论大多是在实验室小试规模的基础上，利用植物提取物或分析纯化合物得到的，也有少数论文通过中试装置或在湖库现场试验利用不同形式的化感物质，证明了该种抑藻技术的实际可行性。
3.1应用案例
Mulderij等在罗马尼亚多瑙河三角洲进行了原位培养试验，并证实化感作用对浮游植物有抑制作用：将天然浮游植物群落暴露于水剑叶(S. aloides)后，水体中藻的生长速率明显下降。该试验对浮游植物总量的抑制率为73%，对蓝藻的IR为60%。Vanderstukken等的研究通过中试生态系统试验评估了沉水植物Elodea nuttallii对浮游植物的控制效果及见效时间，结果表明在4～8周的时间下，现场浮游植物生物量始终保持在较低水平，且通过长时间驯化，浮游植物群落并没有进化出对Elodea nuttallii化感物质的抗性。我国近两年的环境友好型植物源化感物质高效抑藻技术研究与应用示范项目也取得了较好的效果，研究选取3种陆生菊科植物，从中分离鉴定出具有高效抑藻活性的化感物质，并对纯化的化感物质进行包埋固定。该项目已在南京市建邺区沙洲河、南水北调金湖站、太湖梅梁湾等河段投入应用，均取得了良好的抑藻效果。
3.2应用场景及经济成本
不同于投加人工化学药剂可以应对实际水体中的突发水华，化感物质抑藻是一个循序渐进的过程，其应用场景主要为易周期性或频繁发生水华的水体中。自然界中具有抑藻作用的化感物质种类繁多，且其功能靶点和对藻种的特异性各不相同，单纯通过河流湖泊中水生植物分泌的化感物质在量上无法满足控藻的需求，且抑藻化感物质尚未形成规模化生产，导致该技术在实际应用中的经济成本较高。通过投加分析纯的化感物质，或将化感抑藻与其他技术联用，可以弥补提取成本高的缺陷，同时还能改善化感物质在水体中易光解易氧化的不稳定特性。
四、现有研究的问题分析及展望
化感物质由于其高效性、环境友好性和经济有效性，受到越来越多学者的广泛关注，近百种水生和陆生植物已被证实能够释放有抑藻效能的化感物质。随着平板色谱、硅胶柱、改性硅或葡聚糖凝胶色谱、离子交换色谱、毛细管电泳和逆流色谱等技术的发展，这些化学物质也不断从植物体内被分离纯化，并验证其对水华的抑制效能，分析作用机理。化感物质除藻在以下方面尚待进一步开展。
1)明确环境毒性。部分高浓度的化感物质如亚油酸、水杨酸和对羟基苯甲酸，已经被证明对除了有毒藻细胞外的非目标水生生物(如大型溞等)具有一定的毒性作用。明确其生态毒性及作用范围是决定化感物质能否用于实际除藻的前提，此方面已有初步研究，尚需开展进一步细化工作。此外，抑制藻类生长、诱导藻类死亡过程中会导致藻细胞的破裂及胞内物质的释放，影响其他动植物的正常生长，后续研究应予以充分重视。
2)化感物质的投加方式及高效扩散尚需进一步优化。微球固定化解决了局部水体浓度过高的问题，但同样存在由于距投加点距离而产生的浓度梯度，抑藻效果难以均一的问题。结合微球释放规律，通过适当的手段优化水力扰动及强制扩散，有利于强化抑藻效果，推动其在实际工程中的应用。
3)化感物质的固定化尚需进一步改进。目前研究中化感物质的包埋效率有待提高，后续在包埋技术、材料方面也需进一步提升，从而推动化感物质缓释微球在实际工程中的应用。
4)与其他控藻方法的有机组合应用。化感物质在控藻方面具有其典型的特征和优势，但在控藻速率、长效性等方面尚需进一步改进。结合化感物质抑藻途径及机理，充分考虑抑藻途径的互补性及相互影响，探讨适宜的组合控藻途径，有利于高效、经济、安全地控制富营养化水体藻类的过度繁殖。
五、结论
化感物质抑藻具有环境友好、投加便利、成本低廉等优点，在水体和生态修复方面具有广阔的应用前景。在认识各种化感物质的结构差异、有害水华藻种生理特征的基础上，继续发掘具有抑藻效能的新型化感物质，深入探究化感物质抑藻的分子层面机理，改进分离提纯物质的应用形式，优化应用方式及多手段的组合应用，有利于推进化感物质在控藻、除藻领域的实际应用。
