陈银广教授团队：投加甲醇工业园区污水处理菌群及ARGs研究
摘要
甲醇被广泛用作为提高低碳氮比污水处理效果外加碳源，但其对工业园区污水处理，特别是抗生素抗性基因（ARGs）影响的报道较少。通过16S rRNA高通量测序和宏基因组测序等方法，对投加甲醇的新疆某工业园区污水厂（采用氧化沟+MBR工艺）的处理效果、功能微生物丰度和ARGs变化进行了研究。结果表明，甲醇的投加使该工业园区污水厂出水稳定达到GB18918—2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》中一级A标准；具有降解甲基功能的unclassified_c__Gammaproteobacteria和具有反硝化功能的生丝菌属（Hyphomicrobium）在活性污泥的相对丰度分别高达31.92%和28.68%；进水中的ARGs为150.77×10-6，出水ARGs下降到25.77×10-6。研究结果有助于人们深入认识甲醇在工业园区污水处理过程中的作用，并为工业园区污水处理过程新污染物ARGs的控制提供数据支持和理论指导。
研究背景
我国工业园区污水成分复杂且C/N低，采用生物法处理时需要外加碳源进行反硝化生物脱氮。前人研究表明，甲醇、乙酸钠、葡萄糖等常用外加碳源中，甲醇效果好且长期运行费用低，被污水处理厂广泛应用。新污染物抗生素抗性基因（ARGs）的污染与治理已经引起人们的广泛关注，污水处理厂不仅要实现对常规污染物的达标排放，也要对抗生素抗性基因有消减作用。以往的研究较多集中在碳源投加量的计算与优化、投加后的菌群特征及其对反硝化脱氮的影响等方面。实验室研究结果表明，投加甲醇后活性污泥中优势菌多为嗜甲基菌。目前，甲醇投加对ARGs影响的研究只有实验室装置的结果，未见对实际污水处理过程ARGs影响的报道。
本研究采用16S rRNA和宏基因组测序等方法，研究了甲醇投加对新疆某国家级工业园区污水厂的处理效果、微生物菌群组成和ARGs的变化。研究结果有助于人们深入认识甲醇在工业园区污水处理过程中的作用，并为工业园区污水处理过程新污染物ARGs的控制提供指导。
01 材料与方法
1. 污水厂概况和样品收集
新疆某工业园区入驻的企业主要是煤化工、多晶硅、氯碱产业等。该工业园区污水处理厂采用“氧化沟+MBR”工艺，设计处理水量为10.5×104 m3/d，污水处理工艺流程如图1所示，2016年6月通水试运行。
图1 污水处理工艺流程示意
2020年10月，采集该厂进水（A1）、氧化沟好氧段污泥（A2）、MBR膜池污泥（A3）和接触消毒池出水（A4）共4个样品。每个采样点取3个平行样，将3个平行样混合后进行后续处理。水温为16.7 ℃。进水样品进行离心处理，收集离心后的沉淀物。活性污泥样品经自然沉降后对污泥浓缩液进行收集。出水样品经0.22 μm硝酸纤维滤膜抽滤后，收集滤膜上的固体物质。将所有预处理后的样品置于无菌取样管中并放在-80 ℃的低温箱中进行保存。
2. 水质分析方法
COD采用快速消解-分光光度法；BOD5采用稀释与接种法；NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法；NO3--N采用紫外分光光度法；TN采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法；水温采用温度计法。
3. DNA提取方法
利用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，美国）试剂盒进行样品DNA抽提。完成DNA抽提后，使用超微量分光光度计检测DNA浓度和纯度，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。
4. 细菌群落分析方法
对全部样品进行了细菌16S rRNA基因V4-V5区域PCR扩增，引物为515F/907R。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit对纯化后的PCR产物进行建库。利用Illumina MiSeq测序平台进行测序，使用fastp软件对双端原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接。根据97%的序列相似性进行OTU聚类，与Silva数据库比对获得物种注释结果。原始测序数据已上传至NCBI的SRA数据库中，登录号为SRP447627。
5. ARGs分析方法
对提取的DNA进行片段化处理，筛选约400 bp的DNA进行建库。使用FASTP对reads 3’端和5’端的adapter序列进行质量剪切，保留高质量的优化序列（reads）。使用软件MEGAHIT对优化序列进行拼接组装，筛选≥300 bp的重叠群（contigs）作为最终的组装结果。使用Metagene对拼接结果中的contigs进行ORFs预测。将核酸长度≥100 bp的基因翻译为氨基酸序列。用CD-HIT对检验序列进行聚类，构建非冗余基因集。使用Diamond将非冗余基因集与CARD数据库进行比对，比对一致性百分比（Identity）≥80%且比对长度（Alignment length）≥25个氨基酸，获得抗生素抗性功能基因的注释信息，ARGs的单位以“×10-6”计，即每一百万条测序reads中，比对到某一基因的reads数目。原始测序数据已上传至NCBI的SRA数据库中，登录号为SRP311493。
6. 数据分析方法
使用R（v.4.2.1）软件对相关数据进行统计学分析。使用Gephi（v.0.10.1）软件对细菌群落和ARGs进行可视化网络分析。图表的绘制采用Origin 2024软件。
02 结果与讨论
1. 污染物的去除效果
该工业园区污水COD、BOD5、NH4+-N、NO3--N和TN的浓度分别为25~1161, 4~38, 0.48~11.70, 13.10~55.32, 19~148 mg/L。COD变化幅度较大，BOD5和氨氮浓度较低，NO3--N含量占TN的30.63%~92.79%。BOD5/COD为0.01~0.44，污水的生化性差且变化大。BOD5/TN仅为0.05~0.61，生物脱氮所需的碳源严重不足。试运行初期，曾尝试不投加甲醇，但出水不能达标排放。随后，按设计在氧化沟前端24 h连续投加纯度为90.9%的甲醇，投加量为47.49~203.80 mg/L。
投加甲醇后污染物的去除效果如图2所示，可知：甲醇的投加保证了该厂污水处理效果和稳定运行，出水中常规污染物COD、BOD5、NH4+-N、TN等能稳定达到GB18918—2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》中一级A标准。
图2 污水厂进、出水污染物变化与去除率
2. 污水厂细菌群落的多样性
所有样品多样性指数如表1所示。所有样品Coverage指数均>0.988，表明已检测出绝大多数细菌。Shannon、Chao和Heip指数分别用于衡量细菌群落多样性、丰富度和均匀度。新疆寒冷地区城市污水厂菌群的Shannon指数在4~6，Chao指数在1000~3000，表1可知该工业园区污水厂细菌群落的多样性和丰富度均低于该地区城市污水厂。与进水相比，氧化沟好氧段污泥和MBR膜池污泥中的细菌多样性和丰富度明显下降。
表1 细菌群落多样性
3. 污水厂细菌群落的组成
1）细菌门水平群落组成。
所有样品中共检测出36个细菌门，优势细菌门的相对丰度变化如图3所示。变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）相对丰度之和达到了77.78%~87.63%，人类肠道菌厚壁菌门（Firmicutes）仅占0.54%~2.25%。研究表明Proteobacteria参与了碳、氮和硫的循环，包含了大量的功能菌；Bacteroidota对有机碳和蛋白质水解循环等过程有着重要贡献。这两个细菌门广泛存在于各类污水厂活性污泥中，相较于城市污水，Proteobacteria和Bacteroidota在工业废水处理厂中的相对丰度较高。该厂活性污泥中绿弯菌门（Chloroflexi）与进水相比得到了富集，相对丰度达到了9.25%。彭永臻等研究了不同碳源条件下城市污水脱氮效率与微生物群落结构，也表明甲醇为碳源时微生物菌群主要以Proteobacteria为主，同时提高了Chloroflexi在菌群中的占比。Chloroflexi被证明参加了硝化过程的NO2--N氧化过程，对生物脱氮有重要作用。
图3 门水平上细菌群落的相对丰度
2）细菌属水平群落变化。
样品中共检测出572个细菌属，优势细菌属的分布如图4所示。该厂进水中硫膨大杆菌属（Thioclava）、不动杆菌属（Acinetobacter）、芽殖杆菌属（Gemmobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）的相对丰度分别为19.67%、15.80%、10.32%和7.14%。帅异莹研究表明Thioclava参与碳、氮和硫等元素的地球化学循环，能够在含硫、石油类污染物的环境中存活。Acinetobacter和Pseudomonas可利用NO3--N和有机物进行生长繁殖，具有反硝化及硫氧化的能力。
图1 海水无淡化原位直接电解制氢以及海水中N-TiO2在光激发作用下的电解质辅助电荷极化
甲醇投加使氧化沟污泥和MBR膜池污泥中unclassified_c__Gammaproteobacteria和生丝菌属（Hyphomicrobium）的相对丰度高达31.92%和28.68%。同时，具有反硝化功能的橙黄褐指藻杆菌（Phaeodactylibacter）和红游动菌属（Rhodoplanes）在氧化沟污泥和膜池污泥中相对丰度达到3.27%和1.91%。研究表明unclassified_c__Gammaproteobacteria具有代谢甲基的功能，Hyphomicrobium能以甲醇、甲胺等作为碳源和能源进行生长代谢，具有生物脱氮能力。Feng等研究了生物膜处理高硝酸盐含氮石化废水的菌群结构，发现Hyphomicrobium成为经过以甲醇为碳源驯化后污泥中优势菌，相对丰度达到31.8%~61.35%，且Hyphomicrobium与NO3--N和TN浓度呈正相关关系。Sun等研究了不同碳源下反硝化滤池中的菌群结构，表明甲醇为碳源时嗜多甲基菌属（Methyloversatilis）和甲基娇养杆菌属（Methylotenera）等甲基营养菌在反硝化生物滤池发生了富集。本研究中，该厂活性污泥中也检测到Methyloversatilis，相对丰度仅为0.16%，还检测到芽孢杆菌属（Bacillus）、Pseudomonas、副球菌属（Paracoccus）等异养硝化-好氧反硝化菌的存在。因此，该厂投加甲醇培养出的活性污泥中含有丰富的功能微生物，保证了该工业园区污水处理的达标排放。
4. 污水厂中ARGs的变化
1）ARGs类型变化。
该厂检测出的ARGs类型如图5所示。进水中总ARGs相对丰度为150.77×10-6，主要ARGs类型为多重耐药类、磺胺类和四环素类，相对丰度分别为57.53×10-6、33.77×10-6和25.45×10-6。Liang等研究了新疆城市污水厂进水中的总ARGs，相对丰度为191.08×10-6，主要ARGs的类型为多重耐药类、氨基糖苷类和四环素类。该工业园区污水厂与城市污水厂的菌群结构不同，但ARGs类型的差异不大。据报道ARGs在各种复杂化学物质的影响下可能发生变化，形成独特的ARGs结构。尽管该工业园区污水水质复杂，但该厂进水并没有形成独特的ARGs结构。出水中总ARGs下降为25.77×10-6，主要类型为多重耐药类、β-内酰胺类和MLS类，相对丰度分别为17.30×10-6、1.95×10-6和1.61×10-6，ARGs的去除率达到82.91%。
图5 ARGs类型的相对丰度变化
图5显示，与进水相比该厂长期甲醇投加驯化的活性污泥中的ARGs丰度大幅下降。Qu等进行了甲醇为碳源对抗生素去除和ARGs传播的影响实验，表明甲醇与抗生素的联合驯化作用显著降低了污泥中ARGs的含量。Zhang等进行甲醇投加对垃圾渗滤液全程和短程硝化反硝化处理过程中ARGs丰度的影响实验，表明甲醇投加在全程硝化反硝化过程中会提高ARGs的丰度，甲醇的存在可能对微生物群落产生一定的毒性作用，这种毒性效应促使抗性菌的繁殖，从而增加ARGs的丰度。目前甲醇作为外加碳源对ARGs的影响及其机理的研究报道不多，还需进一步深入研究。图5还可以看出，经过NaClO消毒处理后，出水菌群中ARGs与活性污泥中ARGs有所升高。有研究表明，氯消毒并不能消除ARGs风险，反而会导致不同胞外抗性基因的大量产生。
2）ARGs亚型变化。
该厂ARGs亚型分布如图6所示。进水ARGs亚型主要为磺胺类sul2、四环素类tet(C)、多重耐药类msrE，相对丰度分别为26.48×10-6、20.38×10-6和14.64×10-6。氧化沟污泥ARGs亚型主要为多重耐药类adeF、磺胺类sul2、氯霉素类floR，相对丰度分别为0.70×10-6、0.66×10-6和0.62×10-6。MBR膜池污泥ARGs亚型与氧化沟污泥ARGs亚型类似，主要为磺胺类sul2、sul1及氯霉素类floR，相对丰度分别为0.52×10-6、0.44×10-6和0.44×10-6。出水中ARGs亚型为多重耐药类的msrE、adeJ和adeK，相对丰度分别为4.99×10-6、4.48×10-6和4.10×10-6。研究表明微生物组成是影响污水中ARGs分布的重要因素，氧化沟污泥和MBR膜池污泥相似的细菌门、属结构是它们具有相似ARGs结构的主要原因。
图6 ARGs优势亚型的相对丰度变化
5. 污水厂细菌与ARGs相关性
污水厂中的细菌群落结构与ARGs有着密切关系，对相对丰度排名前50的优势细菌属和ARGs之间进行Spearman（r >0.8，P<0.01）的相关性网络分析如图7所示。
图7 属水平上细菌群落与ARGs 的网络分析
通过相关性网络分析了属水平上细菌群落与ARGs之间的关系。Acinetobacter和adeK，Pseudomonas与msrE，Thioclava与mphE之间呈现显著正相关。这些与ARGs之间呈正相关的细菌属通常被认为是ARGs的潜在宿主。Hyphomicrobium与floR，Phaeodactylibacter与tet(39)之间存在显著的负相关关系。这些细菌在ARGs的传播过程中起着重要作用。
03 结 论
1）该工业园区污水可生化性差且生物脱氮碳源严重不足，甲醇投加后常规污染物COD、BOD5、NH4+-N、TN等稳定达到GB18918—2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》一级A标准。
2）经甲醇投加长期驯化，该工业园区污水厂活性污泥中unclassified_c__Gammaproteobacteria和Hyphomicrobium相对丰度达到31.92%和28.68%。
3）该工业园区污水总ARGs相对丰度为150.77×10-6，主要类型为多重耐药类、磺胺类和四环素类；出水总ARGs相对丰度降低到25.77×10-6。网络分析表明，Acinetobacter与adeK，Pseudomonas与msrE之间存在显著正相关关系。
旦澳江1 姚俊芹1∗ 贾阳阳1 赵新伟1 陈银广2（1. 新疆大学 生态与环境学院，乌鲁木齐 830017；2. 同济大学 环境科学与工程学院，上海 200092）
