P3级高生物安全风险车间活毒废水处理风险与对策
导读 Abstract
2019年底至今新冠疫情在全球范围内流行，中国短时间内研制成功新型冠状病毒灭活疫苗，并建设了一批生产新冠病毒灭活疫苗的P3级高生物安全风险车间，安全有效处理车间排放的活毒生物废水至关重要。主要介绍P3级高生物安全风险车间活毒废水灭活处理间及灭活设备的生物安全风险分析与对策。
01活毒废水灭活间与灭活设备
1.1 活毒废水灭活间建设要求
P3级新冠病毒灭活疫苗生产车间防护区有毒废水需要排入活毒废水处理间的灭活设备中进行高温有效灭活，冷却至设定温度后排放至污水处理站进行生化处理。灭活处理设备一般采用序批式灭菌罐通入蒸汽高温消毒（或灭菌）处理，处理能力应与生产规模相匹配，并设有备用处理装置及应急处理措施。定期对活毒废水处理设备的消毒灭菌效果进行验证，以确保达到安全要求。活毒废水灭活处理间应设置在独立的密闭区域且与室外大气压的压差值（负压）应不小于20Pa，应设置独立人流、物流及淋浴系统。
活毒废水灭活处理系统管道连接应保持密闭、安装牢固。所有排水管道应有足够的排水坡度和管径，确保管道内不存水；管道的防护区排水关键节点应按需要安装防回流装置或存水弯（深度应适用于空气压差的变化）或密闭阀门等；排水管道应符合相应的耐压、耐热、耐化学腐蚀的要求，无泄漏，便于维护、清洁和检查。活毒废水排水管道通排气管应设两道高效过滤器或其他可靠的消毒装置，排气高效过滤器更换前，应采用经过验证有效的方法灭菌处理，如采用VHP或蒸汽灭菌。
1.2 活毒废水处理灭活间生物安全等级
病毒性疫苗生产车间生物废水处理的灭活间设施、设备，应收集与生物安全风险相关的资料，对其进行分析、梳理，融入生物安全管理体系。废水灭活间设施和设备生物安全风险管理匹配于生产工艺的风险、产品检验的风险、设施设备维护涉及的风险，设施、设备、材料和外部服务等相关的风险进行风险识别分析、分析评价以及采取的应对措施。
根据病毒性疫苗涉及病原微生物操作的风险，将车间生物安全防护水平分为低生物安全风险车间和高生物安全风险车间。低生物安全风险车间，指减毒株或弱毒株等病原微生物生产疫苗的车间；高生物安全风险车间，指用高致病性病原微生物或特定的菌（毒）株生产疫苗的车间。对于涉及低生物安全风险的车间和设施，应满足现有疫苗生产和生物安全相关要求，高生物安全风险车间产生的活毒废水灭活间设施和设备应符合P3级高生物安全风险车间的建设及管理要求。
1.3 活毒废水灭活间与设施
1.3.1 车间布局
高生物安全风险车间的选址宜远离公共区域，应为独立建筑物，按照生物安全风险分为防护区（车间内生产防护区、活毒废水处理防护区等生物风险较大的区域，需对结构密闭性、个体防护以及废弃物处理等进行控制的区域）和非防护区，活毒废水灭活间属于防护区。
1.3.2 压差要求
应将活毒废水灭活间防护区内气压控制为相对室外大气负压。灭活间（区）的气压（负压）与室外大气压的压差值应不小于40Pa，与相邻工作缓冲间的压差（负压）应不小于15Pa，其余房间与室外方向上相邻相通房间的最小负压差应不小于10Pa。
1.3.3 围护结构
活毒废水灭活间防护区内围护结构的所有缝隙和贯穿处的接缝都可靠密封，穿墙管道使用穿墙密闭器。在通风空调系统正常运行状态下，采用烟雾测试等目视方法检查其围护结构的严密性，所有缝隙无可见泄漏。防护区内所有的门均可自动关闭。所有门均安装闭门器，可实现门的自动关闭。在废液灭活区的核心工作间和控制间之间设置观察窗，材质为耐撞击、防破碎的钢化玻璃。
1.3.4 安保设施
设置物理性安全保障设施：包括视频系统、人脸识别门禁系统、空调自控系统、环境监视系统，能对所有故障进行报警。进入防护区、监控室及设备机房的门均有门禁系统，只有获得授权的人员才能进入。
1.3.5 电气配电
高生物风险活毒废水灭活间应按一级负荷供电，设置UPS电源，其中灭活间照明、VHP传递窗、送风机和排风机、自控系统、监视和报警系统的不间断电源电力供应应至少维持30min。
1.3.6 通风空调系统
活毒废水间防护区送、排风应分别设置备用风机，尽可能减少排风机后排风管道正压段的长度，该段管道不应穿过其他房间。在灭活间防护区送风和排风总管道管道关键节点安装生物型密闭阀，以便送排风系统整体消毒时密闭风管。
1.3.7 自控、监视与报警系统
应有合理的门禁系统，在有负压控制要求的缓冲间、灭活间安装显示房间状况的压力显示装置和压力控制区间提示。中央控制系统应可以实时监控、记录和存储防护区内有控制要求的参数、设施设备的运行状态；应能监控、记录和存储故障的现象、发生时间和持续时间；可以随时查看历史记录。中央控制系统应能对所有故障和控制指标进行报警，紧急报警应为声光同时报警，应在防护区的关键部位设置监视器，需要时，可实时监视并录制车间活动情况和车间周围情况。安装对讲系统或电话系统。
1.4 活毒废水灭活设备
1.4.1消毒灭菌方法及机理
生物活毒废水的消毒灭菌（灭活）通常采用投加化学消毒剂进行消毒和高温加热法消毒灭菌两种方法。化学消毒法在大规模病毒性灭活疫苗活毒废水处理中，因化学消毒剂种类多、消毒效果受微生物种类、浓度、数量、温度、作用时间、pH等因素影响较大，安全可靠性较低，且操作麻烦，易造成二次污染和影响后续生化污水处理工艺效果，化学消毒灭菌法已被高温物理加热法取代。高温对微生物具有明显的致死作用，高温热力消毒灭菌效果好、性能稳定、对自然环境无污染、操作使用方便且易于自动控制等优点。
高温物理热力消毒灭菌法就是采用蒸汽直接通入活毒废水灭菌罐设备内腔与废水混合加热或通入灭菌罐设备夹套间接加热，直接混合加热热效率高，加热时间长，且无需疏水及夹套冷却切换控制操作。通过对灭菌罐内活毒废水的加热，达到或超过某些微生物存活温度并保持一定的持续时间达到灭菌的目的，以确保废水安全排出。高温对病毒、细菌的蛋白质、核酸、酶系统等产生直接破坏作用，热力可使蛋白质中的氢键破坏使之变性和凝固，双链DNA分开为单链，受热而活化的核酸酶使单链的DNA断裂，导致病毒、细菌死亡。
1.4.2 活毒废水处理灭菌罐
（1）灭菌罐设备应采用304不锈钢材质，废水灭活罐体设备的接收和排放管道应采用密闭管道，在密闭状态下完成对活毒废水的消毒灭菌处理。废水消毒灭菌罐应设置保压试验程序，应有意外泄露的防范措施。
（2）物理高温加热消毒灭菌的热能源可以为工业蒸汽、电力等清洁能源，新冠疫苗生产车间一般首选工业蒸汽。将P3级生产车间防护区产生的活毒废水通过专用密闭304不锈钢工业管道排入灭菌罐中，达到液位后通入工业蒸汽加热至121 ℃，保温不小于15min，可完全将废水中的病源性微生物杀死灭活，夹套通入冷却水对灭活后的废水进行冷却至设定温度（如50 ℃）后排入污水处理站与其它废水一并进行生化处理后达标排放。
（3）序批式活毒废水灭菌罐。因国家新冠疫情防控需要，急需大量新冠疫苗满足接种需求，P3级新冠病毒灭活疫苗生产车间产量较大，活毒废水量也较大，采用序批式活毒废水处理工艺较为适宜，能够满足处理要求及生物安全要求，连续式处理工艺适合于实验室小水量消毒灭菌处理。
1.4.3 活毒废水灭菌罐生物安全设计要求
（1）材质要求。灭菌罐设备根据灭活间面积及空间高度，可采用立式罐或卧式罐，采用不锈钢罐体，与废水直接接触内腔部分可采用316，非接触部分可采用304。
（2）控制系统。控制系统人机可视界面清晰直观、操作简单，可触屏控制操作。控制系统大部分采用西门子PLC控制，界面显示单个灭菌罐温度、压力、液位、处理量等参数的监测与控制，具有自我诊断及保护功能，显示面板能显示设备实际运转情况，如系统发生故障（现场故障），具有记忆功能（历史故障）。同时也全屏显示灭菌罐之间联动控制及报警信息，中央控制室还可远程监测与控制。系统分为手动和自动运行状态，手动能单独操作控制；自动由控制器自动控制完成，能保持当前运行状态，故障或其余情况导致停机后，恢复后能继续当前状态运行。系统能自动进水、自动加热、自动灭菌、自动排汽、自动冷却、自动排水等；配有独立的超温、超压、液位报警和系统故障报警。
（3）工艺要求。每台灭菌罐有独立直通式两级除菌呼吸过滤器，进水及预热阶段能自由呼吸，灭菌罐通过1个注液进水口或有压/无压双设进水口注液至设定液位，蒸汽通过电气动调节阀由汽水混合器加热升温至80 ℃（可设定），之后关闭呼吸器继续加热至121 ℃保温20 min灭菌，灭菌结束后关闭蒸汽，夹套通入7/12 ℃冷却水（下进上出）进行冷却，且从蒸汽进口点动通入压空进行搅拌冷却，冷却至50 ℃时关闭所有阀口、顺序开启排水口及罐顶排料压空进行排水，排水直接排入室外污水井后进入污水处理站，排液完成后自来水通过2个喷淋球清洗排水。进水阀、排水阀需带开关反馈功能。
（4）罐体接口设计要求。罐体接口设计要求：冷却水进、出口各1个，罐接收车间废水进口2个（有压/无压各1各），蒸汽进口电气动调节阀（配单向阀）1只，罐体两端双人孔设计（设有视镜、强光观察灯），取样口（蒸汽消毒带单向阀）1个，卡盘呼吸器接口1个，灭菌后排汽泄压口1个，压空排料吹扫进气口1个，压空搅拌进气口（有单向阀、内腔冷却点动搅拌）1各，卡盘安全阀口1个，自来水喷淋球清洗口2个（有单向阀），无死角内腔排水口1个（安装无残留超薄球阀），集水坑泵入罐内进水口1个，夹套冷却水排放口1个，夹套上端冷却水接压空排水吹扫口1个（可设减压阀、设单向阀），废水压入相邻罐应急口1个，验证口2个（每个口三个点可固定芽孢及温度探头，方便操作）、隔膜压力表，温度表，压差液位传感器口，温度传感器口，压力传感器口，及其他功能接口。
（5）罐体取样及灭菌验证功能。罐体应设置废液取样口、温度验证仪探头接口及其验证杆或相关固定装置、生物指示剂放置或固定装置，温度验证仪探头测试应满足121 ℃ 20min，生物指示剂测试应满足嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（如ATCC7953）经过121 ℃ 20min灭菌后阴性。取样检测或芽孢灭菌检测，应符合或达到相关规范、标准。
每个罐体的呼吸过滤器应配置温度验证仪探头接口、生物指示剂放置或固定装置；呼吸器灭菌验证与罐灭菌验证同时进行，验证口放入芽孢，安装带表头显示的温度、压力传感器。有单独的滤芯灭菌控制，能自动完成滤芯更换前灭菌，滤芯灭菌时其他罐能继续进行废水灭菌。
呼吸器滤芯自动灭菌：关闭呼吸阀出口气动阀，从呼吸器上部通入工业蒸汽20 min进行灭菌，下部阀门打开，冷凝水直接排入罐内，同时对空罐加入少许自来水（液位可设定）淹没蒸汽喷头同时蒸汽灭菌，记录仪记录灭菌起止时间及灭菌曲线，灭菌完成后关闭下部气动球阀，呼吸器自然冷却后可更换滤芯。
呼吸过滤器预留完整性检测口，能配合完成在线滤芯完整性检测；呼吸器设置电伴热疏水性除菌过滤器（0.2 μm）：呼吸过滤器必须有相应的安全检修及自动灭菌装置；提供过滤器滤芯材质、合格证及检验报告，滤芯材质应符合相关规范要求，壳体材料采用304，滤器均要求达到生物安全产品标准。
（6）灭菌曲线记录要求。设置有纸记录仪记录运行数据（温度、压力），能够打印每次开始升温、排水结束起止时间及灭菌起止时间，记录仪仅在液位到达设定点开始升温至处理完成排水结束之间打印，其余任何时间不允许打印（灭菌之前停蒸汽则停止打印）记录仪：2台6通道记录仪，1台用于正常废水灭菌处理记录，另一台用于呼吸器灭菌、取样口灭菌及应急管灭菌记录。
（7）蒸汽主管设计要求。先导式减压阀组设置于防护区外，安装单向阀后经生物密闭穿板接头进入废水灭活间，波纹管截止旁通阀1只，过滤器1只，减压阀前后波纹管截止阀2只；灭菌罐蒸汽从主管上方开口接灭菌罐支路蒸汽管，电气动调节阀前安装手动波纹管截止阀1只，主管末端下转变径1/2后经生物密闭穿板接头穿出防护区，在防护区外安装主管疏水阀组，疏水后冷凝水接入冷凝水管。
（8）应急管设计要求。灭菌设备罐与罐之间需要设计应急连通管，当灭菌罐发生故障不能进行消毒灭菌是，可以通过应急连通管将未灭菌的废水倒入相邻罐中和应急管一起进行灭菌处理。罐底设计无死角应急口1个（两罐相连，中间罐需设计2个应急口），安装超薄法兰气动球阀，在应急阀旁应急管上接一三通，三通侧管安装角座阀及单向阀（能单独拆装）接入蒸汽，三通直通口安装手动球阀，灭菌后余水接入集水坑，应急管上设置温度传感器（带表头显示）2个、压力传感器（带表头显示）2个及芽孢验证口。
如1号罐故障，需要将水转入2号罐，打开1号罐应急阀旁的蒸汽阀及2号罐应急阀，通入蒸汽与2号罐一起加热灭菌；如2号罐故障，需要将水转入1号罐后，打开2号罐应急阀旁的蒸汽阀及1号罐应急阀，通入蒸汽与1号罐一起加热灭菌；蒸汽阀前设置共用电气动调节阀及手动波纹管截止阀。应急功能需进行灭菌验证，能完成空罐（或满载）灭菌及应急管道灭菌。
（9）冷却方式。冷却方式有夹套式冷却、后置冷却装置及自然冷却等。夹套式冷却安全性较高，漏液风险小，冷却过程中点动通入压缩空气充分搅拌冷却，冷却时间短；后置冷却装置冷却方式，在P3级高生物安全风险车间不建议采用，高温废水采用水泵打入冷却装置进行循环冷却或直流冷却，容易在泵机及冷却装置处发生泄漏，进入防护区维修困难。
（10）蒸汽加热方式。蒸汽加热方式有夹套式加热、内腔直喷蒸汽式加热及内置盘管式加热。夹套式加热：夹套罐壁较厚，预留接口化学清洗方便，对水质要求不高, 已使用一百多年，较为经典；直喷蒸汽式：需要安装汽水喷射混合器，加热效率高，温升快，蒸汽管中冷凝水较多时，会出现内腔满水事故，需要做好蒸汽主管疏水；盘管式：加热盘管壁薄，效率高, 化学清洗不便，水质差时可能穿孔，进入内腔维修困难，不如夹套式安全。
（11）冗余设计。活毒废水处理灭菌罐是高风险关键设备，需要有1~2台备用灭菌罐，不少于3台联动或循环工作，不设收集罐，因为收集罐的消毒灭菌、验收等操作困难。灭菌罐工作压力也要有冗余设计，如压空及蒸汽等介质的系统压力为0.6~0.8MPa，经过减压后供灭菌罐使用，如果加压失控会导致罐体内腔压力升高，安全阀动作喷泄废液，造成整个防护区的污染，因此可提高罐体的设计压力有效的避免这种情况的发生。
（12）处理水量计算要求。灭菌罐注液时每一个液位数值（cm或mm显示）对应显示进水量体积值，液位变化、体积随之变化，控制屏实时显示每罐的当前处理量、累计处理量、运行次数、系统总处理量，并能记录开始时间，有手动清零按钮，可查询历史记录。
1.4.4 活毒废水处理的关键因素
（1）温度与时间。高温及保持时间是保证彻底杀灭病毒、病原体的关键条件，足够的灭活时间消毒灭菌效果的重要保证。可以设定为121 ℃，保温不少于15min进行高温消毒灭菌处理。
高温对微生物的致死作用也适用于阿伦尼乌斯(Arrhenius）速率定律，即灭菌的反应速度常数见式(1)：
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式中 A——指前因子，也称阿伦尼乌斯常数（频率因子），单位与k同；
e——自然对数的底；
Ea——实验活化能，活化能的变化取决于微生物死亡过程蛋白质的不可逆转反应的性质，一般Ea为250~290 kJ/mol；
R——摩尔气体常数，R=8.314 J/(mol·K)；
T——绝对温度，单位K。
保持时间：一定温度的保持时间，是消毒灭菌效果的重要保证，保持时间可根据需要调整，是自控设备在不同条件验证效果的优势之一。理论上如果灭菌使残留微生物趋近于 0，则灭菌时间趋于无穷大，彻底灭菌几乎是不可能的。在实际应用时，通常以微生物数目降低到原先数量的1/10为一个数量级的对数所需时间表示灭菌程度，以D值表示，通常要求达到灭菌的程度以微生物数目降低6 个数量级，即达到10-6级（百万分之一）为标准，此时灭菌时间F值可表示为6D，可套用公式F=nD，n为灭菌过程中微生物数目降低的数量级。
（2）气密性与消毒。活毒废水处理系统管道连接应保持密闭、安装牢固，不能有任何泄露，应定期对活毒废水灭活系统的消毒灭菌效果进行验证，以确保达到安全要求，活毒废水灭活系统排气应设两道高效过滤器或其他可靠的消毒装置，排气高效过滤器更换前，应采用经过验证有效的方法（如采用VHP）灭菌处理。
（3）冷却与排放。废水被加热到121 ℃保持灭菌时间，高温有效灭菌后须冷却到50 ℃左右才能排放。冷却方式有整体夹套冷却方式、外置盘管冷却方式、内置盘管冷却方式、外置直冷换热器或循环装置冷却。夹套或外置盘管冷却方式可降低废液泵机的泄漏风险，夹套冷却过程中可以向已灭菌的内腔脉冲通入压缩空气搅拌冷却，也可同时打开内腔泄压阀进行夹套冷却，这样冷却效果较好，冷却水建议采用软水冷水系统。
废水冷却后排放之前，可以取样进行生物学检验，确认消毒彻底。理想的排放方式为压空排料，可以较小泵机泄漏风险，而且罐底吹扫较为干净。
（4）结垢和清洗。废液进入灭菌罐中，废水中的颗粒杂质和化学物质在高温下会产生物理、化学变化，废水中悬浮物等细小颗粒在高温高压下会结垢或腐蚀内壁，应定期检查结垢或腐蚀情况，具有在线清洗功能，每处理完一批应能自动喷入清水进行冲洗管壁，减缓结垢及腐蚀情况效果较好。也可以采用化学药剂清洗，确认清洗剂中不含氯离子或含量较小，否则对不锈钢腐蚀较大。
02废水灭活系统运行风险管理
2.1 活毒废水处理失败风险与对策
每年定期进行灭菌罐设备灭菌效果的验证，确认每一批次活毒废水灭菌条件为加热至121.0 ℃，不少于15min灭菌处理。严格按照活毒废水处理系统SOP执行操作，自动记录灭菌关键参数，以便跟踪检查。灭菌完成冷却后进行批次取样检测，样本未检出阳性，废水可以排放，否则需进行二次灭菌处理。定期对活毒废水处理系统的排放下游的污水处理站采样，进行新冠病毒核酸检测或活病毒培养，对排放的废水进行监测，以确认安全排放。
2.2 灭菌罐设备泄漏风险与对策
灭菌罐罐体材料采用不低于304不锈钢，在高温下耐酸碱、耐腐蚀，在罐体投入使用前需进行保压测试合格。
罐体下方设有不锈钢围堰，将泄漏控制在一定空间内，一旦发生泄漏，工作人员按照应急预案规定的处置流程进行应急处置。围堰表面敷设漏液报警器，报警信号在中央监控系统定义为紧急报警信号，一旦漏液触发报警，中控值班人员和工作人员须按规定程序进行处置。若发生小量地漏，可以采用包覆毛巾并喷洒75%酒精消毒处理，毛巾卷曲放入生物安全垃圾袋；若发生大量泄漏，废水进入收集沟自流入活毒废水集水坑，通过水泵将其泵入活毒废水灭菌罐进行灭菌处理，地面及收集沟积液可用应急柜内的84消毒液或含氯消毒剂泡腾片消毒处理。
2.3 活毒废水呼吸器及进水通气管泄漏风险与对策
灭菌罐使用两级除菌呼吸过滤器，定期进行更换，更换前对滤芯进行消毒，在更换前后均进行过滤器完整性检测，保证运行过程中过滤器完好。活毒废水处理系统进水通气管废气经过两级高效过滤后排出。过滤器运行状态按照SOP定期进行巡查，过滤器完整性定期进行检测，通气口定期进行采样检测。
在活毒废水处理系统的性能确认阶段进行呼吸过滤器及进水通气管两级高效过滤器在线灭菌效果确认。
2.4 停电引起的泄漏风险与对策
厂区应自建10 kV高压变电站，采用一级负荷供电，10 kV双回路全备供供电，并设置发电机及UPS电源，正常运行时由专线主供线路供电，主供线路故障时可以自动切换至备供线路供电；线路计划停电前供电部门均会通知电力管理人员，确保市政供电可靠。当市电故障时，UPS电源将会维持灭菌罐设备及相关设施供电，保证灭菌罐设备继续运行。断电切换经过验证，且每年进行一次断电检测，确保供电切换及供电时间正常。
03小 结
新冠灭活疫苗P3级高生物安全厂房活毒废水处理间及处理设备必须与生产核心防护区要求一致，生物安全第一，严格管控，标准操作，杜绝泄漏。进入高生物安全风险车间工作的员工，需进行培训并考核合格，才允许上岗，严格执行双人工作制度，确保工作配合及互救安全。事先做到足够的风险分析与评估和应急预案演练，大多数生物安全事故都是可以避免的。
目前，国内制造活毒废水处理设备的技术已比较成熟，制造工艺好，无需进口，国产设备质量保证体系完善，售后服务到位，完全能满足生物安全要求。灭菌设备一个严格的自动控制系统工程，需从系统的角度分析风险、解决问题，任一环节出问题，必然带来整体的不安全。充分考虑运行维护管理的方便和操作简单，便于人工维修与清洗，确保生物安全。
