剩余污泥胞外聚合物/EPS用于种子包衣潜力
编者按
从剩余污泥中提取出的胞外聚合物（EPS）对生菜和菠菜种子进行包衣。种子涂上胞外EPS后，在高温、高湿条件下储藏效果大大提高。对包衣和未包衣种子进行陈化，包衣种子发芽势、发芽率和抗氧化酶活性与未包衣种子相比具有明显差异。此外，包衣生菜和菠菜种子中的CAT、POD和APX活性分别提高了56%、2%和17%（生菜），包衣菠菜种子中CAT、POD和APX活性分别提高了8%、3%和31%（菠菜）。在盆栽试验中，可溶性蛋白质和可溶性糖含量以及抗氧化酶活性也分别提高了42%和56%（生菜）以及34%和23%（菠菜）。因此，EPS有助于防止一些稀有、珍贵种子陈化。本文发表于《Sustainable Chemistry and Pharmacy》（2024年5月）
文章亮点
1、首次探索了利用从活性污泥中提取的胞外聚合物（EPS）作为新型种衣剂来防止种子陈化之可能性。
2、新型种衣具有可应用于稀有、珍贵种子包衣，以防止陈化问题。
3、包衣种子发芽势、发芽率和抗氧化酶活性与未包衣种子相比具有明显差异。
4、EPS在防止种子高温、高湿条件下陈化方面表现出色，其效果相当于2年恢复期。
1、EPS及种子表征
利用傅立叶变换红外光谱对活性污泥（CAS）中提取的胞外聚合物（EPS）官能团进行分析，如图1（a）所示。其中2960 cm-1和2930 cm-1分别代表碳水化合物类、脂类物质中的C-H结构；1800 cm-1~1200 cm-1中的特征峰代表了蛋白氨基基团酰胺结构；1072 cm-1处的特征峰代表了多糖的C-H结构；950 cm-1特征峰代表了核酸物质的O-P-O结构。同时，EEM对EPS的表征如图1（b）所示。其中，含量最多的Ⅳ区域对应于色氨酸，这对应于EPS中蛋白含量。此外，EEM光谱I区和II区并未观察到明显荧光峰，表明该嵌段中并没有芳香族蛋白。
图1 EPS的光谱表征
通过SEM观察到了喷涂EPS与否下不同倍数的生菜、菠菜的表面形貌，如图2所示。未喷涂EPS的生菜种子在10 µm条件下可观察到表面有许多固体颗粒，进一步放大至100 µm条件下可观察到表面有许多纵向沟壑，并夹杂着固体状纤毛，如图2（a）所示，这表明种子表面凹凸不平且粗糙。与之形成对比的是，喷涂EPS后的生菜种子表面光滑，这表明EPS均匀的涂敷在种子表面，并在种子表层形成了一层致密的EPS薄膜，如图2（b）。进一步地，通过EDS能谱质量占比分析表明喷涂EPS后的N含量提升约2.5倍，磷含量从原来的0.06提升至2.26，见表1。
图2 喷涂EPS与否后的种子表面的SEM：生菜—未涂覆EPS（a）；生菜—涂覆EPS（b）；菠菜—未涂覆EPS（c）；菠菜—涂覆EPS（d）。
2、种子酶活性
图3展示了种子的各种酶活性。无论是CAT，POD，还是APX，在第0天（种子未陈化）时喷涂EPS与否，其值变化不大，说明EPS中的组分对酶的测试基本无影响。单就CAT酶而言，无论喷涂EPS与否，种子内部酶活性均随陈化时间延长而降低。
与CAT不同的是，POD、APX酶活性在陈化初期都有明显的上升趋势，随后会持续下降。生菜、菠菜的POD酶活性都是在第1天急剧上升，随着陈化时间的延长急剧下降，说明种子长期处于高温、高湿环境下，已经超过了种子的耐受性，不能分泌更多的酶来抵御不利环境，故而在此之后缓慢下降。APX酶活性也是如此，只不过其耐受性较POD更强一些。
图3 种子的酶活性：喷涂EPS与否后的种子随着陈化时间的不同，种子内部的CAT过氧化氢酶（a）(b)；POD过氧化物（c）(d)；APX抗坏血酸过氧化物酶（e）（f）活性变化（以出芽后第八天为准），生菜（a）（c）（e）；菠菜（b）（d）（f）
3、植株发育情况
涂敷EPS与否后生菜、菠菜种子的生长指标可以直观的观测到EPS涂层对种子陈化的影响。图4表明在生菜的生长过程中，喷涂EPS后的种子在第3、5天的发芽势和10天的发芽率明显高于未喷涂EPS后的种子，且无论喷涂EPS与否的生菜种子都会随着陈化时间延长发芽势逐渐降低。生菜种子陈化第4天开始，无论是发芽势还是发芽率，未喷涂EPS的种子发芽率较喷涂EPS的种子发芽率急剧下降。在这几种指标中，菠菜种子的发芽势、发芽率变化更加明显，陈化2天后发芽率大幅降低至50%左右。实验中还观察到了种子异常发芽的情况，即，菠菜种子在陈化第4、5天时种子异常发芽，尤其在第4天发芽势、发芽率异常增高；这种异常发芽率会随着陈化时间的延长而增加，甚至达到了正常发芽率的50%。
图4 喷涂EPS与否后的种子经不同陈化时间的发芽势、发芽率，分别以播种后第3（a）（b）；5（c）（d），10（e）（f）天为准，生菜（a）（c）（e）；菠菜（b）（d）（f）
4、植株组分及酶活性
植物体内的各种成分指标和酶活性也是表征植物陈化程度的重要指标。图5展示了生菜、菠菜植物的可溶性蛋白和可溶性多糖的含量。喷涂EPS后的生菜植株均比未喷涂EPS的生菜植株的可溶性蛋白和可溶性多糖要高，蛋白差距甚至达到1倍以上。随着陈化天数的增加生菜植株的可溶性蛋白和可溶性多糖的含量缓慢减少，说明种子经陈化后对植株的生长起到了一定的抑制作用。尽管如此，喷涂EPS后的生菜种子在陈化2天内要好于原种子，在之后的陈化时间内喷涂EPS与否相差不大甚至有上升趋势，这可能归咎于测试误差。同样地，菠菜出芽的植株也有类似的现象。
图5 生菜、菠菜的成分指标：喷涂EPS与否后的种子随着陈化时间的不同而出芽的植株的SP（a）(b)；SS（c）(d)含量变化（以出芽后第十天为准），生菜（a）（c）；菠菜（b）（d）
图6展示了不同种子出芽第十天后，其植株内部各种酶含量随陈化程度的变化。不难看出，除少量测量误差外，喷涂EPS后种子出芽植株，在同等环境下，优于未喷涂的种子。特别是无论生菜，还是菠菜，在陈化条件中有毒物质的积累还会使蛋白质失活，而大部分酶（CAT、POD、APX）属于蛋白的一种，最终导致酶活性和蛋白含量呈现出相同的下降趋势。且前文提及到，种子中主要酶的活性在陈化过程整体降低，其中CAT酶急剧下降，而POD和APX存在先上升后下降的趋势。我们惊奇的发现，在植株内部的酶活性也有着同样的趋势。这说明种子内部本身酶活性积累情况直接会反映到后来对应植株生长的内部酶活性结果。如生菜种子中POD在陈化两天后积累最高，其植株也是在陈化两天后积累最高。这也更加辅助说明了，EPS对种子和植株的保护主要是在防止种子的陈化阶段。
图6 植株的酶活性：喷涂EPS与否后的种子随着陈化时间的不同而出芽的植株的CAT过氧化氢酶（a）(b)；POD过氧化物（c）(d)；APX抗坏血酸过氧化物酶（e）（f）活性变化（以出芽后第十天为准），生菜（a）（c）（e）；菠菜（b）（d）（f）
5、结论
当植物受到任何胁迫时，都会产生许多活性氧自由基，从而导致脂质过氧化等有害影响。此时，植物体为了抵御胁迫作用会增强抗氧化系统活性。实验表明，与未喷涂EPS种子相比，喷涂EPS种子的酶活性得到了有效提高。发芽率、发芽势和抗氧化酶活性均优于原种子，表明EPS能有效延缓脂质过氧化。这可能是因为EPS中含有N和P等营养物质，可以为植物提供营养补充。此外，在种子表面喷涂EPS会形成一层致密薄膜，从而减少高温、高湿处理对种子造成的损害，进一步延缓种子的陈化。
