陈红教授团队：饮用水中抗生素抗性基因分布及暴露风险研究进展
曾光曙 周振超 林彦含 葛子冶 林泽俊 帅馨怡 周津羽 陈红*
（浙江大学 环境与资源学院环境技术研究所，杭州 310058)
研究背景
抗生素耐药细菌（antibiotic resistant bacteria，ARB）及抗生素抗性基因（antibiotics resistance genes，ARGs）被认为是广泛分布的新兴环境污染物。而医院和农业环境中抗生素的过量使用和滥用，促使ARGs在不同的环境介质中的出现、扩散和累积，包括土壤、沉积物、地表水、废水和地下水，甚至在饮用水中。抗生素耐药性（antimicrobial resistance，AMR）被认为是二十一世纪最严重的公共卫生挑战之一。
由于水环境具有促进抗性基因迁移和演化的理想条件，因此被认为是ARGs的重要储存库。水环境中的ARGs可以通过食物链、饮用水等方式传递给人类。ARGs在世界各地的饮用水厂出水、饮用水分配系统以及家用自来水中均已被检出。传统的饮用水处理工艺不能有效去除ARGs。
本文收集文献报道的世界各地自来水厂出水、配水系统输送水和末端龙头水中ARGs的检出情况，对当前全球饮用水中的ARGs分布概况、处理和运输全流程中影响ARGs丰度的各项因素进行分析；初步计算饮用水中ARGs的人体暴露剂量，评估健康风险；对不同饮用水处理工艺的ARGs去除效率进行了比较分析。
摘要
抗生素耐药性的传播已成为全球性的公共健康问题，饮用水作为抗生素抗性基因（antibiotics resistance genes，ARGs）向人体迁移传播的重要途径，其携带的抗性基因及潜在暴露风险引起了广泛关注。本文基于已发表的饮用水抗生素抗性基因相关研究，分析了全球范围饮用水中ARGs的分布及其影响因素，探究了适用于表征饮用水中ARGs人群暴露剂量及暴露风险的评估方法，并探讨了当前常规饮用水处理技术在控制ARGs方面的作用及局限性。未来的研究可从传播性、人类致病性等多维度对饮用水抗生素耐药风险进行系统性评估，针对ARGs去除需开发新型水处理技术对其进行强化处理。
01、饮用水中ARGs的丰度
1. 饮用水处理系统中ARGs丰度
目前，各国饮用水的微生物指标通常只侧重于粪便污染和致病菌指标，而ARGs的赋存状况与传播尚未得到足够的重视。ARGs可以从人类和动物来源转移到不同的环境，包括饮用水源和自来水，从而对健康造成风险。因此，了解ARGs在饮用水生产、输送与使用各阶段中的丰度以及饮用水处理厂（drinking water treatment plant，DWTP）的去除效果，有着重要的意义。
图1给出了全球各地饮用水中检测到的ARG平均丰度及范围。饮用水中tetA和sul1具有较高的绝对丰度，分别高达2.42×104~1.38×105 copies /mL和1.57×103~2.01×105 copies /mL，虽然饮用水处理过程中ARGs的绝对丰度有所降低，但相对丰度没有显著差异。Huang 等在昆明城市各水系统季节性取样检测，发现饮用水与污水厂出水中的ARGs丰度远低于城市排污口、河道、污水厂管网及进水，其中饮用水中ARGs的绝对丰度约为1.23×106 copies/L。长江沿岸两座饮用水处理厂的出水中也有大量sul1、sul2和intI1的检出，绝对丰度为1.1×102~9.5×104 copies /mL。Xu等在杭州采集了两座受人类活动影响程度不同的DWTP的水样，虽然两座DWTP的原水中ARGs的丰度和检出数量均有显著差异，但两座DWTP出水中ARGs的检出数量相近，均为115~120个，ARGs的绝对丰度在102~105 copies/mL之间。
图1 世界各国饮用水中ARGs的丰度状况
2. 供水管网中ARGs丰度
传统的饮用水处理工艺不能完全消除原水中的ARGs，水厂出水中的ARGs通过管网输送可能会进一步迁移传播。有报道称，供水管网出水中ARGs的绝对丰度水平显著高于水厂出水。从中国天津某饮用水管道中连续取样1年，在自来水样品中共发现了14种细胞外ARG（extracellular antibiotic resistance gene，eARG）类型，其中，tetC的检出率最高，为66.7%，其次为sul1、sul2和qnrA（41.7%），blaTEM、tetM和ampC的检出率为33.3%。这些数据表明，氯化过程并没有完全消除细菌释放的eARG。在全年采集的样品中，总eARG丰度范围为0~1.4×102 copies /mL，细胞内ARG（intracellular antibiotic resistance genes，iARG）的绝对丰度范围为1.1×102~3.2×103 copies /mL。Xu等对杭州某饮用水厂出水与供应末端居民用水进行比较研究发现，管道输送后ARGs的绝对丰度显著增加，尤其是β-内酰胺类抗性基因，从水厂出水的1.08×104 copies /mL增加到自来水中的5.12 ×105 copies/mL。类似地，大多数种类ARGs在自来水中的相对丰度比水厂出水有所升高。丰度的升高表明饮用水输送系统可能是ARGs传播的重要场所，应引起重视。
3. 龙头水中ARGs丰度
由于各国家与地区之间饮用水处理现状与取用习惯的不同，饮用水使用点的水质状况存在较大差异，因而呈现的ARGs丰度水平也不一致。罗马尼亚大多数农村人口通过家庭水井供应饮用水，其ARGs相对丰度范围为6.61×10-7~2.30×10-1 copies/16S rRNA copies。R. Destiani等从英国伦敦九个随机地点收集了自来水样本，除mph（A）和blaTEM-1基因在两个采样点未检测到外，tetA、dfrA7和sul1基因在所有采样点均检出。Yu等对黄河兰州段五处饮用水位点的四季取样分析发现，自来水中ARGs绝对丰度在4.98×10-2~1.70×103 copies /mL之间波动；整合子intI1在自来水中存在最高的绝对丰度（9.98×103 copies/L），其次是sul1基因（5.73×103 copies/L）。华南地区三条河流为水源的饮用水中，ARGs总丰度（绝对）分别达到1.89×105±2.90×104 copies/mL、1.74×104±2.39×103 copies/mL和1.18×104±1.62×103 copies/mL。2017年对全球25个城市饮用水进行的宏基因组分析，共检测到16种ARG类型的181种ARG亚型，相对丰度范围为2.8×10−2~4.2×10−1 copies/16S rRNA copies。最高的ARG相对丰度均在中国北部地区检出（河南4.3×10-1 copies/16S rRNA copies、河北3.7×10-1 copies/16S rRNA copies），，比最低的海南省南部地区高约12倍。新加坡和美国的饮用水检测到中度丰度的ARG（1×10-1~1.2×10-1 copies/16S rRNA copies，），且两者ARG组成相似。Zhang等对中国71座城市家庭水龙头出水进行检测，发现总ARGs的丰度范围为5.48×101~1.31×104 copies/mL，其中磺胺类抗性基因的含量较高，其中23个城市的总ARGs含量超过平均值，占所有城市的32.40%，48个城市（67.60%）的指标低于平均水平（4.13×102 copies/mL）。
02、影响饮用水中ARG丰度的因素
1. 氯消毒
氯消毒对ARG多样性和绝对丰度的降低具有积极作用，但对ARG相对丰度的作用有限。余氯通过抑制DWDS中的细菌以保证水安全。足够高的游离氯可以与细胞壁发生反应，导致细胞失活，但对ARGs去除有限。而且氯和氯胺的亚抑制浓度可提高细菌间ARGs的接合转移和转化效率。对南京北河口自来水厂氯消毒阶段的检测结果表明，短期氯消毒（2~4 h）可促进饮用水中的抗生素耐药性。宏基因组分析显示，加氯后ARGs的多样性和丰度都显著增加，但在饮用水运输过程中则大幅减少。饮用水氯消毒处理后，mexF、blaTEM、aph33ib和cmL_e3的丰度分别增加了106.0倍、10.3倍、10.3倍和8.5倍。经管网输送后，mexF、blaTEM、qacE△1和blaKLUA的丰度分别降低了34.7倍、2.5倍、17.0倍和3.0倍。研究发现，紫外线、氯、一氯胺等消毒剂可诱导细菌（包括ARB）进入活的但不可培养（viable but nonculturable，VBNC）状态。尽管进入VBNC状态的细菌很少增殖，但它们仍保持了代谢活性和毒力，并比可培养的同类细胞表现出更大的抗生素耐药性。值得注意的是，随着环境条件的变化，VBNC状态的细菌具有恢复其增殖能力的潜力。因此，这些VBNC细菌通过饮用水进入人体时，如复苏可能带来健康风险。
2. 生物膜
研究表明，DWDS中90%以上的细菌存在于生物膜中，细胞外聚合物质（extracellular Polymeric Substances，EPS）使不同的微生物在管网表面定植。EPS使细菌保护自身免受残留消毒剂的影响。生物膜中抗生素和重金属可以促进抗生素抗性的传播。Zhang等在一个真实的DWDS中持续检测一年的结果表明，生物膜和出水中ARB的浓度和相对丰度均高于进水。高通量测序发现出水中不动杆菌、鞘氨单胞菌和缓生根瘤菌含量高于自来水。生物膜上细菌群体感应及其信号分子促进了ARGs的传播。
3. 微污染物
饮用水中的微污染物（重金属、微塑料、抗生素等）能够显著影响ARGs 的产生与迁移过程。研究发现重金属碲（Te）的抗性基因与自来水中的ARG（acc6ib）相关。环境水基质中的Te含量通常只存在于超痕量水平（低于1 μg/L），研究强调了饮用水中重金属污染与ARG之间的密切关系。磺胺嘧啶和环丙沙星分别为水源水中常见的磺胺类和喹诺酮类抗生素，在饮用水中以痕量水平(1~4 ng /L )被检出。研究发现这些抗生素是sul1、sul2、sul3、qnrB和qnrS促进的主要决定因素。水体中抗生素的累积和持久性，可能会给微生物带来选择压力，从而引起ARGs的汇集。
4. 季 节
黄河流域冬季自来水ARGss丰度明显低于其他季节。Huang等研究发现，春季自来水中的ARGs相对丰度要高于冬季。对中国北方某城市郊区两个DWDS采样点的研究表明，自来水中共检测到11种ARG及35个亚型，夏季总相对丰度显著高于冬季，达到了0.133 copies /cell，其中以多重耐药类型的ARGs为主（0.098 copies /cell），其次为β-内酰胺类（0.01 copies /cell）。总体而言，饮用水中的ARG具有明显的季节特征，通常呈现出冬天丰度低，其他季节丰度升高的趋势。
03暴露剂量与风险
ARGs对人体的危害很大程度上取决于暴露剂量。目前常用的环境健康风险评估方法是基于潜在剂量的外暴露评估法，该法适用于大规模人群的暴露评估。而ARGs在地球生态系统无处不在，已经有研究揭示ARB可将ARGs传播给人体肠道内的其他条件致病菌。HGT也有助于细菌耐药性在人体肠道中的传播。然而人类对ARGs暴露风险，特别是饮用水途径的ARGs暴露风险知之甚少。研究ARGs人群暴露特征，通过饮用水中ARGs丰度数据与人均饮用水摄入量，计算人群对ARGs的暴露剂量，可为准确评估ARGs健康风险提供依据。
1. 摄入方式
人类暴露于ARB的常规途径是饮用水、娱乐和灌溉用水、污水或抗生素生产废水、食物以及空气。而饮用水途径的主要暴露形式包括饮用、沐浴以及气溶胶扩散（图2）。已有研究发现，相比饮用未受污染或经过充分处理水的，饮用含携带ARG的大肠杆菌污染的水参与者患病率高26%。由于ARB与ARG之间的密切关联性，这一定程度上也可以反映饮用水途径可能带来的ARG暴露风险。在中国的一项研究发现，家庭饮用水净化器中共检测到13种主要ARGs的121种亚型。根据从英格兰13个指定浴场分离出的大肠杆菌的ARG相对丰度，估计出该环境区间的大肠杆菌平均携带1.24个ARG。因此，参加水上运动时人们面临较大的ARGs暴露风险。
图2 饮用水中ARGs的人体暴露途径
2.人群暴露剂量计算
暴露参数是进行暴露评估的重要参考资料。根据美国环境保护署（environmental protection agency，EPA）发布的暴露因子手册（2011年版），美国饮用水人均推荐量为1043 mL/day。而欧盟（european union，EU）开发了 ExpoFacts 数据库，其中包含来自 30 个欧洲国家的数据，并给出欧洲饮用水人均推荐量范围为375~971 mL/d。中国也于2014年完成了《中国人群暴露参数手册（成人卷）》，提出中国成人的饮用水人均推荐值数据为1850 mL/d。
从文献和暴露参数手册中提取各国饮用水人均推荐量与ARGs浓度数据，将浓度数据按照国家地区进行分类汇总，确定其总平均浓度和标准偏差。各国饮用水的 ARGs 平均浓度（copies /L）与人均饮用水摄入量（mL/d）相乘得到饮用水的 ARGs 暴露量。饮用水途径抗生素抗性基因暴露量计算公式如下：
由于目前研究的饮用水中ARGs丰度研究大多集中在中国，因此，根据公式计算得出通过饮用水摄入的ARGs暴露量在中国为2.2×106 copies/d。但需要强调的是，中国饮用水（通常是煮沸的）的加工可大大降低抗生素抗性基因的摄入量。所以通过该途径摄取的ARGs健康风险，还需要更进一步的系统研究。
3. 饮用水抗性基因风险评估
可移动基因元件（mobile genetic elements，MGE）可用于ARGs向环境传播的风险评估。人类肠道含有各种抗生素耐药性决定因素，统称为“肠道耐药组”。饮用水中的ARG可能会转移到条件致病菌和其他肠道微生物中。目前为止，较少有研究专注于确定饮用水厂系统中ARGs的移动性和宿主致病性，而针对饮用水中ARGs的风险评估，可以基于Zhang等[59]最近提出的抗性基因组健康风险评估方法，从ARGs的人体可及性（HA）、移动性（MO）、致病性（HP）和临床可用性（CA）4个维度进行考虑，公式如下：
RI =HA ×MO × HP × CA
式中：HA代表ARG从环境转移到人类细菌群的能力；MO表示ARG通过HGT在宿主之间转移的能力；HP特异性地代表了ARG从非致病性宿主转移到致病性宿主的能力，这会导致病原体对抗生素产生耐药性，从而无法控制临床感染；CA代表ARG针对药物的临床可用性。
有研究表明，存在于人类细菌病原体宿主MGEs上的ARGs具有较高的耐药基因组传播风险。如果某种ARG对最常用的抗生素具有耐药性，那么它的健康风险高于其他ARGs。将RI>0的ARGs确定为风险ARGs，并根据其RIs的排序将其分为4类（Q1~Q4）。相对而言，具有高风险（Q1、Q2）的ARGs主要集中在氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类和外排泵类耐药基因，因为它们具有很高的临床可用性和人类可及性。Xu等研究发现，饮用水经管道输送后ARGs的绝对丰度显著增加，尤其是β-内酰胺类ARGs。对以长江为水源的饮用水厂的水样进行宏基因组分析，发现绝对丰度较高的ARGs包括四环素类ARG（tetA）和磺胺类ARG（sul1），在所有样品中均有检出。对全球25个城市饮用水样品中的ARGs进行宿主分析发现，除未能分类的序列外，携带ARGs的序列中有34.5 %来自于假单胞菌属，其中高达80%的ARGs介导多重耐药。这与从医院污水处理系统分离的铜绿假单胞菌情况类似，约有82%的菌株对多种抗生素耐药。而铜绿假单胞菌是一种难以治疗的病原菌，可引发严重的感染。饮用水中假单胞菌携带ARG的普遍性可能会增加人类的健康风险。
04饮用水ARGs的控制
饮用水的处理主要包括为规模化饮用水厂的前端处理以及家用净水器的末端处理，前端的规模化处理不可或缺的步骤，而后续的末端处理则因地区而异。规模化的前端处理通常采用混凝、沉淀、吸附等物理处理工艺对原水中进行初步处理，此过程中对耐药细菌及抗性基因的削减效果非常有限，而通过后续的多级水处理消毒技术以及组合消毒处理技术可以进一步灭活耐药微生物以及游离的胞外抗性基因。此外，类型各异的家用净水器也使得饮用水水质进一步提升。然而，这些处理过程在达到了较好处理效果的同时，也存在着一些抗生素耐药风险。不同饮用水处理工艺组合ARGs的去除效率见表1。
表1 各饮用水处理工艺的ARGs去除效率
1. 规模化饮用水厂的处理
1）物理处理工艺。
饮用水厂的物理处理过程主要包括过滤和沉淀。Su等发现，在饮用水厂处理系统中，通过砂过滤、沉淀等方式可以有效地去除ARGs。Guo等调研发现，在砂过滤后，ARGs的绝对丰度下降，而tetC和tetG的相对丰度上升。沙滤中经常使用的石英砂，通过将水相中的微生物和悬浮颗粒物除去，从而将附着在其上的ARGs去除。用聚氯化铁和三氯化铁混凝，对sul1，sul2，tetO，tetW，tetQ和intI1的去除作用可达到0.5~3.1个对数的量级。
活性炭（activated carbon，AC）因其巨大的比表面积以及发达的孔隙结构而具有强大的吸附能力，可以有效去除饮用水中的杂质的同时对于水中的有机物和消毒副产物也具有较好的吸附效果。Xu等模拟了多级生物过滤系统发现过滤了携带抗生素的进水后，颗粒活性炭的表面生物膜中的ARG的相对丰度最高，同时与沙子和无烟煤相比，颗粒活性炭介质促进了ARG在生物膜中的水平转移，这对于生物过滤的抗生素耐药管理提出了更高的要求。
2）消毒处理工艺。
紫外消毒。紫外照射消毒技术广泛应用于水处理过程中微生物的灭活，可以通过对核酸的物理损伤针对性去除饮用水中的耐药细菌以及抗性基因。Shen等使用0.38 mJ/cm2 UVC对耐四环素的蜡样芽孢杆菌和细小芽孢杆菌进行消毒，发现至少5.7 log失活（初始浓度为6 log）并抑制ARG表达。Chen等发现低强度的紫外照射引起了细菌的氧化应激反应并导致相关防御修复基因的上调表达，促进了大肠杆菌菌株之间质粒的共轭转移效率。由于紫外线不具有消毒持久性，ARB和ARGs可能通过光活化和暗活化在管网中恢复。因此，要彻底灭活细菌，必须对原有技术进行改进或与其他技术结合使用。Zhang等对饮用水水源中多重抗生素耐药菌假单胞菌进行了紫外、氯化和紫外/氯化处理，发现3种技术都可以高效的灭活目标菌株，而紫外/氯化联合处理能更有效地去除sul1和intI1。
氯消毒。作为使用最广泛的消毒方法之一，氯消毒对ARB具有较强的灭活效果，但对ARGs的去除存在争议。研究发现，氯化消毒导致ARG丰度显著降低，去除率为30.6%（2 mg/L）和33.1%（4 mg/L）。Lin等研究也表明氯化降低了119种ARGs和12种MGEs的相对丰度。但也有研究者认为，氯消毒对ARGs的处理效果并不显著。加氯消毒可有效降低ARGs的绝对丰度，但可能使其相对丰度升高。Shi等发现使用二氧化氯消毒会富集ampC，aphA2，blaTEM-1，tetA，tetG，ermA 和ermB，但是对sul1却有去除作用且效果显著。而这可能是由对消毒剂和抗生素的交叉或共抗性的潜在机制引起。
2. 家庭净水器末端处理
市政供水管网的长距离运输及停滞有利于细菌生长。在家庭饮用水使用点，许多消费者选择采用家庭活性炭净化器（household activated carbon water purifiers，HWPs）对自来水进行进一步净化。已有研究表明，HWPs被认为可以有效地去除水中的污染物。活性炭、离子交换树脂、超滤膜和反渗透过滤器等材料被应用在HWP中。
AC一般作为商用净水器超滤或反渗透处理部分的前/后过滤单元在HWPs中得到广泛应用。AC在饮用水处理中用于改善味道或气味，并对有机物、消毒副产物、藻类毒素和重金属等污染物进行控制。然而，微生物逐渐栖息在粗糙的吸水性表面活性炭上，并随着时间的推移形成生物膜。Zhou等发现6种不同家用AC净水器80d运行后的过滤水以及AC生物膜的研究发现，HWP的AC中生物膜随时间延长增厚并释放至水中，AC生物膜中ARGs的多样性高于自来水，生物膜是饮用水中RGs的重要来源。
05总结与展望
饮用水中的ARGs污染是关乎人类抗生素耐药风险的关键问题。世界各地的饮用水中都已检出相当丰度的ARGs，通过饮用水厂和家庭净水器的处理仍不能完全将ARGs去除，这加大了我们对人体ARGs暴露剂量及风险的担忧。现有研究对饮用水中ARGs的检测与管控仍不够全面。今后需对饮用水厂和家庭净水器的ARG处理技术、DWDS中的ARGs污染调控方法以及暴露于饮用水ARGs下的人体风险评估展开深入探讨。
1）研究调查各国家与地区的ARGs具体丰度情况与传播性，尤其是人口较多但发展水平较低的国家。抗生素的滥用以及饮用水的不规范处理可能导致未来无药可用的情况首先在这些地区发生。
2）针对饮用水中已检出的β-内酰胺类、四环素类等主要ARGs，从传播性、人类致病性、临床可用性等多角度展开深入的风险评估。
3）加强抗生素使用管理并改进饮用水厂处理工艺，从源头和末端多措施并举最大化降低饮用水中的ARGs丰度。耦合传统消毒技术，例如紫外/氯化等联合处理技术，探索更多的耦合形式，是控制饮用水中ARGs扩散的较为有前景的方向。
