老化轮胎微塑料对剩余污泥厌氧发酵产酸的影响
导读：塑料污染问题日益严峻,尤其是颗粒尺寸小于5 mm的微塑料(microplastics,MPs)。从赤道到两极的海洋和沿海陆地均发现MPs污染,MPs可进入食物链并具有生物富集效应,MPs污染成为焦点。
以生化技术为主的污水处理系统产生大量剩余污泥,厌氧消化是目前应用最广的污泥稳定化处理技术。研究发现,部分MPs对消化系统具有明显的抑制作用。例如,30粒/(g SS)的聚对苯二甲酸(PET)MPs可减少10%的甲烷产量,100～200粒/(g SS)的聚乙烯(PE)MPs抑制了27.5%的甲烷产量,投加0.2 g/L的聚苯乙烯(PS)MPs导致发酵系统启动时间延长等。同时,MPs对于微生物群落整体结构和多样性影响较小,而对于单一功能细菌(如水解菌和产酸菌)丰度有显著抑制。上述研究主要针对原始MPs对厌氧发酵系统影响的问题,而MPs在污水处理过程中由于机械磨损以及光、热、微生物等化学和生物的降解作用,会发生老化,引起理化性质较大改变。老化MPs可能对污泥厌氧发酵产生不同的影响,对比尚缺乏研究。
橡胶轮胎在汽车行驶过程中磨损产生的轮胎微塑料(TMPs)是水中MPs重要来源。TMPs是我国排放数量最多的MPs种类(占总排放量的53.9%),我国沿海省份橡胶轮胎微粒释放量约为19万t/a。橡胶轮胎成分复杂,主要包括橡胶(质量分数为40%～50%,)、填充剂(质量分数为30%～35%)、柔软剂(质量分数为10%)、硫化剂(质量分数为2%～5%)和添加剂(质量分数为5%～10%)等。因此,TMPs被检出含有锌、铜、多环芳烃、苯并噻唑等有毒物质,TMPs浓度较高时对生物体产生明显的致畸性、致突变性等亚致死毒性效应。雨水管网和受纳水体均有检出TMPs的报道,在合流制和分流制排水体制中,TMPs均可随雨水进入管网和污水厂,TMPs对于污泥厌氧发酵系统的影响亟待揭示。综上,原始MPs对污泥厌氧发酵产生影响,而排水管网和污水处理系统中的MPs经过环境老化过程,最终在剩余污泥中累积,因此,探究老化MPs对污泥厌氧发酵的影响具有重要意义。本文以TMPs为研究对象,采用化学法模拟环境老化过程,研究不同浓度的老化TMPs对剩余污泥厌氧发酵产酸过程影响,揭示老化TMPs的毒性效应和影响机理,为保障污泥处理工艺稳定运行提供技术支撑。
一、材料与方法
1.1试验材料
剩余污泥取自南京市某城市污水处理厂二沉池,经过滤去除大颗粒杂质,接着在4 ℃条件下重力浓缩6 h,用于厌氧发酵试验,浓缩后污泥的理化性质如表1所示。
表1 试验污泥的理化性质
TMPs购于陕西某橡胶制品厂,该厂以废旧轮胎为原料,经破碎、分选和研磨粉碎等工序制成TMPs。试验用的TMPs平均粒径为107.7 μm。
1.2试验方案
1.2.1 TMPs老化
模拟MPs环境老化的过程主要采用酸、紫外或臭氧等物理化学方法。通过不同老化方法的对比研究发现,强酸法在表面形态、元素和官能团组成等方面,对TMPs和PE等MPs都具有明显的老化效果,适宜作为自然老化的替代方法。因此,本研究采用强酸浸泡法模拟TMPs在污水处理过程中的老化,具体步骤如下:取20.0 g TMPs于500 mL锥形瓶,加入1 mol/L的H2SO4溶液400 mL并混匀,在150 r/min振荡条件下老化15 d。然后分别经过超纯水清洗,0.45 μm微滤膜过滤,自然风干,对滤膜表面截留的老化TMPs颗粒进行扫描电镜(SEM)和粒径分布测试。
1.2.2 污泥厌氧发酵
采用4个体积为500 mL的血清瓶作为厌氧反应器,顶部安装橡胶塞并插入塑料导气管,导气管另一端与集气袋连接,收集产生的气体。反应装置如图1所示。首先,每个反应器中加入400 mL剩余污泥,采用NaOH溶液调节pH值为10.0,将未投加MPs的反应器标记为AF-0,设置投加原始TMPs 0.2 g/(g VSS)的反应器为AF-1,根据不同质量分数[0.002、0.020、0.200 g/(g VSS)]投加定量的老化TMPs颗粒,反应器分别记为AF-2、AF-3、AF-4;接着,向反应器内通入氮气以排除多余的空气,并用橡胶塞密闭;最后,将反应器置于恒温水浴振荡器[水温为(35±1)℃,振荡速度为150 r/min]中厌氧发酵8 d。发酵期间每天取样一次,每次样品体积约为20 mL,样品在5 000 r/min条件下离心10 min后,取离心上清液经0.45 μm滤膜过滤,测量样品的挥发性有机酸(VFAs)、SCODCr、蛋白质、总糖、活性氧(ROS)等浓度以及微生物酶活性,每组样品测试分析设置3个平行。
图1 剩余污泥厌氧发酵产酸反应器
1.2.3 TMPs浸出液
采用与发酵试验相同的血清瓶作为反应器,投加与发酵试验相同浓度的老化TMPs以及400 mL纯水,反应器分别记为JC-1、JC-2和JC-3,然后在恒温水浴振荡器中振荡8 d,水温为(35±1)℃,振荡速度为150 r/min。每天取样一次,每次取样50 mL,测量总有机碳(TOC)浓度,每组样品测试分析设置3个平行。
1.3分析方法
1.3.1 VFAs的测定
采用气相色谱法(安捷伦7890B气相色谱仪),载气为氮气,流速为25 mL/min,分流进样(分流比为0.1∶1),进样量为0.5 μL,单个样品测试时间约为11 min。
1.3.2 酶活性和ROS测定
通过酶活性和ROS指标变化考察老化TMPs对污泥厌氧发酵酶和细胞活性的影响。取适量发酵污泥进行稀释,采用试剂盒(南京建成)标准测试方法,使用Synergy H4型酶标仪测定蛋白酶、α-葡萄糖苷酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶(LDH)以及ROS含量。
1.3.3 其他检测方法
pH、SCODCr、蛋白质、多糖、TOC等指标参照《水和废水检测分析方法》(第四版)。粒径分析采用马尔文2000激光粒度仪,SEM采用日立S-4800冷场发射扫描电子显微镜。
1.3.4 数据分析
采用Microsoft Excel 2010和Origin 2017对数据进行分析,使用IBM SPSS 26.0 软件对皮尔逊相关系数和显著性水平P值进行分析,若P<0.05认为差异性显著。
图2 不同老化TMPs浓度下污泥厌氧发酵系统pH值变化
二、结果与讨论
2.1老化TMPs对厌氧发酵产酸的影响
污泥厌氧发酵过程中,pH变化引起生物膜电位改变,影响酶活性和新陈代谢,进而影响发酵产酸性能。通常,污泥厌氧发酵系统适宜pH值为6.5～7.2。发酵过程中,各反应器的pH变化如图2所示。系统初始pH值约为10.0,发酵前4 d,系统pH值快速降至6.6左右,5 d后污泥厌氧发酵系统pH值趋于稳定。这是因为发酵反应初期,VFAs的生成使系统迅速酸化,然后酸性物质产量下降,系统pH保持稳定。由图2可知,AF-4反应器的pH在整个发酵过程中始终高于其他反应器,表明该反应器中酸性物质产量少于其他组。
图3 不同浓度老化TMPs下厌氧发酵系统
(a)产酸量和(b)VFAs组分变化
VFAs产量是评价发酵系统效能的重要参数。不同老化TMPs浓度下,发酵系统VFAs产量如图3(a)所示。各反应器VFAs浓度都随着发酵时间的增加而升高;发酵前期VFAs浓度增长速率较快,5 d后增加增长速率减缓,浓度趋于稳定,上述变化趋势与系统pH变化相似,可见发酵前期pH降低主要是由于产生的VFAs累积。图3(a)中,AF-4反应器产酸量明显低于其他反应器,在发酵第5 d时AF-4反应器产酸量仅为1 012.9 mg CODCr/L,约为其他反应器(AF-0、AF-1、AF-2、AF-3)产酸量的63.9%、65.5%、63.1%、66.0%,反应结束时产酸量仅为对照组AF-0和AF-1反应器的78.5%和81.2%。由此可见,高浓度[0.200 g/(g VSS)]的原始TMPs和低浓度[0.002、0.020 g/(g VSS)]老化TMPs对发酵系统未造成明显的毒害作用,但高浓度[0.200 g/(g VSS)]的老化TMPs可明显抑制发酵系统产酸过程。Wei等发现低浓度PVC-MPs[10粒/(g SS)]可少量提高VFAs产量,但在高浓度时[20～60粒/(g SS)]显著抑制,与TMPs表现一致。本研究中,在发酵前3 d内,所有反应器中MPs都未对系统造成明显的抑制作用,在第2 d和第3 d时均观察到原始TMPs和低浓度老化TMPs可少量促进产酸,可能是反应前期发酵底物充足、功能微生物活性较高所致。随着发酵过程不断进行,老化TMPs对发酵系统产酸的抑制逐渐显现。
VFAs物质组成对于后续厌氧产甲烷具有重要影响,以乙酸为代表的VFAs也是生物合成甲烷的主要原料。第8 d时6种主要的VFAs占比变化如图3(b)所示。各组发酵液中乙酸和丙酸占VFAs总量的80.0%以上,其他4种挥发酸(异丁酸、正丁酸、异戊酸、和正戊酸)的占比相对较小且无明显差异。5组反应器(AF-0、AF-1、AF-2、AF-3和AF-4)中,乙酸质量浓度分别为1 133.3、1 111.3、1 121.9、1 123.4 mg CODCr/L和970.5 mg CODCr/L,高浓度[0.2 g/(g VSS)]原始TMPs对乙酸产量无明显影响,并且AF-4反应器的乙酸含量浓度与其他组差距较小。而5组反应器中乙酸占比分别为59.3%、60.17%、60.2%、62.2%和64.7%,丙酸占比分别为22.9%、20.51%、21.3%、18.2%和16.4%,可见随着MPs浓度增加,乙酸占比增加,丙酸占比减小。已有研究发现,投加Fe3O4可以促进厌氧发酵定向生产偶数碳VFAs(乙酸和丁酸)。与此类似,本研究中老化TMPs的存在可促进乙酸并抑制丙酸的产生,影响程度随发酵系统老化TMPs浓度的增加呈现明显的升高趋势。因此,一方面,高浓度[0.200 g/(g VSS)]老化TMPs抑制系统中总VFAs产量,另一方面,高浓度老化TMPs中胁迫下的产酸微生物更能充分利用其他VFAs作为底物高效转化为乙酸,从而减小与其他反应器的乙酸产量差距。由于上述两种因素相互作用,老化TMPs可能对污泥厌氧发酵产乙酸过程抑制有限。
2.2老化TMPs对厌氧发酵水解的影响
大分子有机物水解是污泥发酵的第一阶段,SCODCr浓度是考察污泥水解效率的关键指标。图4为不同老化TMPs浓度下发酵系统SCODCr浓度变化。各组反应器中SCODCr均随发酵时间而增加,第8 d时,AF-0、AF-1、AF-2、AF-3和AF-4反应器中SCODCr质量浓度分别为2 903.3、2 808.7、2 823.1、2 662.7 mg/L和1 740.6 mg/L。整个发酵期间,投加MPs的反应器中SCODCr浓度始终低于对照组反应器,其中高浓度原始TMPs对SCODCr浓度抑制不显著,而随老化TMPs浓度增加,发酵液SCODCr呈现明显下降的趋势,例如第8 d时AF-4反应器SCODCr浓度较AF-0、AF-1、AF-2和AF-3反应器分别减少了40.0%、38.0%、38.3%和34.6%。可见,相比原始TMPs,老化TMPs可抑制与水解相关的微生物或生物酶活性。
图4 不同浓度老化TMPs下发酵液SCODCr变化
污泥发酵过程中,胞外聚合物(EPS)首先水解为蛋白质和多糖等有机物,这些可溶性有机物继续水解生成VFAs,是VFAs的重要产生途径。图5展示了在不同浓度老化TMPs影响下,发酵液中蛋白质和多糖浓度的变化。各反应器中蛋白质和多糖的浓度随发酵时间不断增加,并与SCODCr变化趋势相同。第8 d时,AF-1反应器蛋白质和多糖含量为AF-0的93.5%和96.7%,高浓度[0.200 g/(g VSS)]的原始TMPs对微生物厌氧水解过程无明显影响;但AF-4反应器蛋白质和多糖含量较AF-0降低21.5%和18.6%,表明高浓度老化MPs抑制了蛋白质和多糖的生成。Wei等研究表明,投加高浓度[60粒/(g SS)]的PET会抑制厌氧发酵功能微生物对蛋白质和多糖的水解,并且产酸和产乙酰等生化反应过程也被抑制。结合2.1小节发酵液有机酸产量与乙酸占比的试验结果,AF-4反应器VFAs产量较低的主要原因可能是厌氧发酵产酸底物的生成步骤被抑制,发酵液中可生物利用底物(蛋白质和多糖等)含量不足,将导致厌氧发酵产酸微生物活性降低从而削弱产酸效果。
图5 不同浓度老化TMPs下
发酵液中(a)蛋白质和(b)多糖浓度
2.3老化TMPs对厌氧发酵酶活性河ROS的影响
微生物酶活性与发酵效果密切相关,蛋白酶和α-葡萄糖苷酶可将大分子蛋白和多糖水解为小分子氨基酸和葡萄糖,是污泥水解过程的两种主要酶。如图6所示,蛋白酶和α-葡萄糖苷酶的相对活性为AF-0>AF-2>AF-1>AF-3>AF-4,AF-4反应器中蛋白酶和α-葡萄糖苷酶的相对活性仅为AF-0反应器的86.3%和89.2%,表明老化TMPs抑制了发酵系统中水解酶的活性,使蛋白质和多糖的水解效率降低。同时,老化TMPs对于蛋白酶的抑制作用更强,这与发酵液中蛋白质和多糖的浓度试验结果(图5)一致。乙酸激酶可催化乙酰辅酶a生成乙酸,是乙酸生成途径的关键控制酶,其活性决定乙酸的生成量。与水解酶的试验结果相似,乙酸激酶活性随着MPs浓度增加而减弱,AF-4反应器乙酸激酶活性仅为AF-0反应器的83.0%。综上,老化TMPs通过抑制水解酶、产酸酶等功能酶活性从而抑制厌氧发酵过程。
图6 不同浓度老化TMPs下厌氧发酵系统中酶相对活性和ROS水平
当细胞膜严重受损时,存在于细胞内的LDH被释放到细胞外,因此,LDH是表征微生物细胞膜完整性的重要指标。由图6可知,含有MPs的反应器中,LDH的释放量为对照组的113.1%、115.8%、121.9%、124.5%,表明老化TMPs进入厌氧发酵系统,破坏微生物细胞完整性,导致部分厌氧发酵微生物死亡,细胞死亡后裂解,原本只存在于细胞内的LDH被释放到细胞外,使得胞外LDH浓度增加,这与Zhang等研究结论一致。
ROS是一类含氧的化学活性物质,包括超氧化物（·O2-）、羟基自由基(HO·)和过氧化氢(H2O2)等,厌氧条件下也可生成/存在,是表征厌氧发酵系统氧化应激效应的重要指标。微生物细胞中产生过量的ROS会破坏氧化还原平衡,引起细胞过氧化及炎症反应,导致细胞损伤或死亡。由图6可知,老化TMPs进入发酵系统后,ROS浓度明显升高,AF-4反应器现象最明显(较对照组升高23.6%)。可见,高浓度的老化TMPs可促进细胞生成ROS,产生氧化应激,从而抑制发酵过程。
2.4老化TMPs对厌氧发酵的影响机理
研究表明,TMPs老化后理化性状发生明显变化,对环境行为产生较大影响。本文从表面形貌及化学物质溶出角度,阐述老化TMPs对发酵的影响机理。
2.4.1 老化TMPs的表面形貌变化
采用SEM观察老化前后MPs表面细微结构的变化。如图7所示,原始的TMPs颗粒完整,表面平滑且结构致密;酸老化15 d后,TMPs颗粒被破坏呈破碎状,颗粒表面粗糙,孔隙率明显增加。同时,老化后TMPs表面有较小的凸起结构并呈现脱落的趋势,这是因为强酸进入TMPs颗粒,扩大了颗粒内部孔洞和缝隙等结构缺陷,从而造成TMPs表面物质逐层剥离脱落,内部结构破坏碎裂,整体呈现粉化状态。同样,研究人员发现,橡胶态PE在老化后也出现了类似的层状凸起和絮状残屑脱落现象。
图7 老化前后TMPs表面形貌
通过粒径分布变化探讨TMPs老化前后的颗粒粉化效果。如图8所示,原始TMPs颗粒平均粒径为107.7 μm,酸老化后平均粒径降为70.9 μm,减小了约34.2%。
上述结果表明,强酸对TMPs颗粒表面造成明显的破坏,碎裂为粒径更小的颗粒,试验观察到酸老化后最小粒径约为2 μm。研究表明,微米级别的MPs颗粒可穿透EPS,聚集在细胞膜上造成细胞膜损伤,影响膜蛋白活性和营养物质传递等细胞新陈代谢功能;纳米级别的MPs颗粒可进入细胞膜,改变膜结构,显著影响分子扩散过程,进而影响细胞活性。可见,MPs粒径越小(例如老化TMPs颗粒),对微生物影响越大,并且小粒径MPs浓度越高,对污泥厌氧发酵系统的影响越大。因此,老化TMPs颗粒结构被破坏和粉化现象是抑制污泥发酵系统的重要原因。
图8 老化前后TMPs颗粒粒径分布
2.4.2 老化TMPs中有毒物质的溶出
MPs在水中可浸出塑料单体和添加剂等有毒物,例如聚氯乙烯(PVC)浸出液含有添加剂双酚A(BPA),对厌氧消化产甲烷阶段具有明显抑制。轮胎制造时加入抗老化剂、硫化剂和活性剂等添加剂以改善产品性能,这些添加剂通常具有生物毒性。图9～图10为不同浓度的老化TMPs浸出液中TOC浓度和三维荧光光谱。由图9可知,随着老化TMPs浓度增加,浸出液TOC浓度上升,第8 d时JC-3反应器TOC浓度较JC-1和JC-2反应器分别提高37.3%和30.4%,这与不同浓度老化TMPs对污泥发酵系统的抑制强弱顺序一致;此外,老化TMPs有机物浸出速率较快,第1 d浸出量可达总量85%左右,这意味着浸出物对于发酵系统的影响贯穿整个发酵过程,并且可能存在毒性累积效应。Capolupo等研究表明,对于藻类和贻贝,TMPs浸出液中有机物含量较高,导致TMPs浸出液毒性大于其他种类MPs的浸出液。三维荧光光谱能特异性识别有机物,被广泛运用于溶解性有机物的检测。由图9可知,反应器JC-3浸出液在激发波长Ex为230 nm左右、发射波长Em为350 nm左右有明显吸收峰,并且吸收峰强度随老化TMPs浓度增加而增加。这些物质主要是由苯丙烷衍生物形成的苯丙素类化合物。研究发现,TMPs浸出液含有苯丙噻唑、多环芳烃和多种挥发性有机物,其中,苯丙噻唑和多环芳烃具有较高生物毒性。老化TMPs浸出苯并噻唑等毒性有机物也成为抑制污泥发酵系统的原因之一。
图9 老化TMPs浸出液TOC浓度变化
综上,老化TMPs影响污泥厌氧发酵的机理如图11所示。(1)老化TMPs的直接作用。纳米级别的老化TMPs能附着细菌细胞壁上产生凹陷和纳米孔,造成细胞膜通透性,并且在进入细胞后改变细胞内氧化还原循环和破坏细胞结构,造成微生物死亡。(2)老化TMPs的间接作用。在发酵系统中,苯丙噻唑等有毒有机物持续从老化TMPs浸出,影响细胞酶的活性;同时有毒物质与老化TMPs颗粒在细胞中会诱导产生的ROS,产生氧化应激效应,从而抑制厌氧发酵产酸。
图10 老化TMPs浸出液三维荧光光谱
图11 老化TMPs对发酵微生物的影响机理
三、结论
本文探讨了老化TMPs对剩余污泥厌氧发酵产酸的影响,并从酶活性、颗粒表面形貌和有机物浸出等角度探究了老化TMPs的影响机理。得出结论如下。
(1)老化TMPs抑制污泥发酵产酸和厌氧水解过程,并且抑制程度随老化TMPs浓度增加而增强。老化TMPs可能通过抑制大分子有机物水解步骤从而抑制发酵产酸效果。
(2)污泥发酵功能酶(蛋白酶、α-葡萄糖苷酶和乙酸激酶)相对活性随系统中老化TMPs浓度增加而减弱,LDH和ROS的变化趋势则相反。
(3)老化TMPs的致毒机理包括老化后TMPs颗粒物理结构被破坏,粒径减小,同时浸出有毒有机物,造成微生物氧化应激反应,细胞酶活性被抑制。
