脂多糖对EPS凝胶特性影响：颗粒与絮状污泥间差异
编者按：EPS与钙离子相互作用形成的凝胶特性使其可广泛应用于其高值领域。絮状污泥与颗粒污泥EPS均可与钙离子形成凝胶，但前者表现为不稳定流态型，而后者则为固体稳定型。这种差异导致絮状污泥与颗粒污泥EPS应用潜力不尽相同。着眼于探究二者产生差异的可能原因，研究以EPS中脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）作为出发点，通过不同手段分析其主要组成结构糖苷和脂质，确定了LPS成分与结构可能对EPS凝胶特性的影响。主要表现为絮状污泥EPS的LPS含有较少糖苷、较短的链长度、较低的分子量，并且可能还含有不饱和脂质，导致LPS-Ca聚集体表现为反转结构，促使EPS-Ca呈现流态凝胶特性；而颗粒污泥LPS结构与之相反，呈现固体稳定凝胶。该研究从物质成分结构角度揭示了EPS凝胶特性差异原因，为后续污泥EPS应用产品开发奠定了基础。该成果将发表于2025年《Water Research》杂志。
文章亮点
01、LPS成分与结构影响EPS凝胶特性
02、LPS分别占絮状和颗粒污泥EPS的25%和15%
03、絮状污泥LPS表现更小分子量糖苷并存在不饱和脂肪酸
04、LPS-Ca聚集体呈现的反转结构导致EPS-Ca作用只能形成不稳定流态凝胶
05、双层/多层LPS-Ca结构使颗粒污泥EPS-Ca形成稳定固态凝胶
01、研究背景
胞外聚合物（EPS）被认为是生物膜结构的关键成分，它们是形成絮状污泥和颗粒污泥空间结构的重要基质。EPS有趣的性质是其与金属离子形成凝胶的能力，Seviour等研究发现颗粒污泥EPS能形成稳固凝胶，而絮状污泥EPS并不能。之后，Lin等研究了EPS与CaCl2溶液形成离子凝胶的特性，发现颗粒污泥EPS-Ca机械性能远强于絮状污泥EPS-Ca。对于该凝胶形成的解释主要基于蛋白质和多糖与钙离子之间的相互作用；而Seviour等认为是糖胺聚糖而非蛋白质导致形成稳定凝胶，其认为聚糖包含羟基和羧酸盐基团，可以与钙离子结合。
文献研究显示聚糖主要包括游离多糖和糖缀合物（糖蛋白和糖脂）。前期研究发现LPS（糖脂，往期链接）是絮状污泥EPS的重要糖聚合物之一，认为LPS可能是EPS-Ca聚集体形成的关键成分。LPS具有两亲特性，脂质A为疏水部分，聚糖为亲水部分（包括核心寡糖和O抗原）。脂质A相对保守，它通过磷酸基团和/或羧酸基团与钙离子配位。但LPS中的聚糖部分差异极大，其也可与钙离子形成交联结构。这些研究表明LPS确实存在与钙离子相互作用的活性位点。那么两种污泥——絮状污泥和颗粒污泥中的LPS有何异同？这些异同又是如何影响EPS与钙作用形成水凝胶？这些是理解EPS凝胶形成的关键。
为此，本研究分别获取絮状污泥和颗粒污泥，并提取EPS，进一步分离LPS，测定单糖、表征官能团，并比较聚糖部分和脂质A部分的差异；同时通过染色显像LPS与钙离子聚集体相互作用结构，以期揭示LPS成分对EPS凝胶形成的贡献。该研究近期录用并发表于《Water Research》。
02、主要结果
EPS凝胶特性表征可以看到，颗粒污泥EPS可以形成稳定的固体凝胶，而活性污泥也能形成凝胶，但其无法保持固定形态，呈现流态状态。进一步分析污泥EPS中LPS 含量，可以看到，颗粒污泥EPS中LPS量远低于絮状污泥EPS。EPS的碳水化合物含量在16%-22%，LPS量也高达15%-25%，从这一可观含量角度可以看得出LPS可能对EPS结构具有显著贡献，它们的结构和性质会影响EPS特性。
表1 不同絮状污泥和颗粒污泥的EPS和LPS产量
图1 EPS水凝胶测试，氯化钙溶液（CaCl2，2.5%，w/v），EPS浓度约为1.5%±0.3%（图片来自原文）
采用Pro-Q Emerald染色SDS-PAGE分析了O-抗原的链长度分布，结果显示所有LPS都具有阶梯条带，意味着所有LPS都包含O-抗原部分。分析该结果也发现颗粒污泥LPS具有相对较长的糖链。
图2 使用Pro-Q Emerald试剂盒对SDS-PAGE中的脂多糖（LPS）进行染色。Std表示来自大肠杆菌055血清型的LPS标准品。D、R、U和G分别表示从Delft, Rotterdam, Utrecht和Garmerwolde污水处理厂EPS提取的LPS样品（图片来自原文）
通过HPAEC-PAD对LPS单糖定量分析，发现颗粒污泥LPS糖单体总量高于絮凝污泥LPS，即含有更多的糖苷，具有较长的糖链。计算不同糖单体相对摩尔百分比，结果显示部分糖单体的相对摩尔百分比超过了20%。而絮凝污泥和颗粒污泥LPS的显著区别在于甘露糖和核糖含量不同：颗粒污泥LPS富含甘露糖，而絮凝污泥LPS富含核糖，较高摩尔百分比的甘露糖可能会增加亲水特性并影响糖苷分子大小，可提供更多的氢键和分子间相互作用。总而言之，这些不同糖单体组成的变化也会影响聚合物形态。
表2 不同糖单体摩尔百分比和总糖在LPS中占比
通过FTIR分析LPS官能团，LPS光谱中典型的1550 cm⁻¹的酰胺II（-NH）峰消失，这些峰在原EPS样品光谱中信号很强，这表明在LPS提取过程蛋白酶预处理切断并剥离EPS中所有蛋白质。1630 cm⁻¹处振动主要来自脂质A中N-乙酰氨基葡萄糖部分的酰胺I（O=C-NH）。更重要的是，絮凝污泥和颗粒污泥LPS在FTIR光谱中观察到了不同峰：
1）颗粒污泥LPS中1040 cm⁻¹（C-O-C）峰和1630 cm⁻¹（N-乙酰氨基葡萄糖的酰胺I）峰强度高于絮凝污泥，说明颗粒污泥LPS含有更多的糖苷。
2）1700-1750 cm⁻¹波数区域对应于脂质A中的酯羰基（-C=O）吸收。颗粒污泥LPS光谱出现了1735 cm⁻¹和1718 cm⁻¹的两个峰，这些峰在絮凝污泥LPS光谱中几乎不可见。C=O基团可以与水分子或邻近极性基团参与氢键相互作用，这些羰基带位置和强度反映了酯羰基的氢键状态，即1718 cm⁻¹峰归因于氢键羰基，而1735 cm⁻¹的峰归因于非氢键结合的（游离的）羰基。颗粒污泥1735 cm⁻¹处较强峰表明脂质A的密度较高和/或脂质层更紧密。
3）絮凝污泥LPS光谱1000 cm⁻¹以下的波数区域（峰值约为780、865、920和965 cm⁻¹）存在一些峰带，而颗粒污泥LPS光谱这一区域相对平滑。这些带对应于不饱和脂肪酸链中反式二取代烯烃（-CH₂）振动。与饱和脂肪酸相比，含有反式不饱和脂肪酸，物质会相对松散而无法紧密堆积。这也可以解释为什么在絮凝污泥的LPS光谱中未出现1735 cm⁻¹的强峰。总之，FTIR光谱分析表明，与颗粒污泥LPS相比，絮凝污泥LPS含有更少的糖苷，并且脂质A中可能存在不饱和脂肪酸，这限制了其结构聚集紧密度。
图3 不同污泥脂多糖官能团图谱（4000-2800 和1800-600 cm-1，图片来自原文）
进一步研究LPS在EPS-Ca水凝胶形成起到的作用，使用显微镜观察了LPS与钙离子聚集体形态。所有LPS与钙离子均能相互作用，形成了聚集体。但聚集体大小差异显著，絮凝污泥LPS-Ca聚集体大多约为10-20 µm；而颗粒污泥LPS-Ca聚集体大得多，范围在100-400 µm之间。使用基于多粘菌素B的荧光探针，通过用荧光探针罗丹明B标记，LPS-Ca聚集体的特定形态通过荧光信号被清晰地显像。所有LPS-Ca样品中观察到了一些相似的形态。然而这些LPS-Ca聚集体之间存在显著差异。絮凝污泥LPS-Ca显示出更疏松的反向结构，聚集结构之间存在水相，其中LPS-Ca Delft呈反转胶束态，LPS-Ca Rotterdam呈反转杆状。相比之下，颗粒污泥LPS-Ca形成了更密集的结构，其中LPS-Ca Utrecht为双层多层囊泡（洋葱状），LPS-Ca Garmowolde为球形。
图4 脂多糖（LPS）与氯化钙相互作用形成水凝胶的测试。a) 相差显微图像显示了LPS与氯化钙形成的颗粒结构。比例尺：100 μm。b) 使用标记有罗丹明B的多粘菌素B对LPS-Ca结构进行可视化。共聚焦显微镜图像通过CY3滤片拍摄，比例20 μm（图片来自原文）。
03、研究讨论
【碳链长度】
LPS作为EPS重要组分之一，研究分别从絮凝污泥和颗粒污泥提取LPS并进行了特征分析和比较。LPS由糖苷和脂质A组成。从糖苷部分来看，颗粒污泥LPS含有更多的糖苷，具有更长的糖苷链和更高分子量。而脂质A部分，颗粒污泥LPS脂质A聚集更为紧密。此外，颗粒污泥LPS 红外光谱中几乎没有观察到不饱和脂质。相比之下，絮凝污泥LPS中明显存在不饱和脂质（反式构型）。使用基于多粘菌素B的荧光探针进行染色，观察到颗粒污泥LPS-Ca聚集体呈双层/多层结构，而絮凝污泥的LPS-Ca聚集体则呈反转结构。
LPS是两亲性分子，可以在水溶液中形成多种聚集结构。这些结构类型与临界排列参数（critical packing parameters, CPP）相关，该参数公式为 CPP=V/(a₀*lc)，其中V是疏水部分体积（本研究中是脂质A体积）；a₀是基团的面积（此处为糖苷部分的最佳面积）；lc是疏水尾部长度（脂质A长度）。根据文献，LPS的脂质长度相对固定，可假定lc对于两种污泥LPS是相同的。基于此，CPP比较可以简化为 VlipidA/aglycans，这意味着脂质A和糖苷部分差异可能会影响LPS-Ca聚集体的形态。研究表明絮凝污泥LPS具有不饱和脂肪酸链（反式构型），这些链由于双键导致了结构上的弯曲，从而增加了脂质A的体积。在糖苷部分，絮凝污泥LPS具有相对较短的糖苷链长度和较低的分子量，导致糖苷最佳面积a较小。絮凝污泥LPS脂质A的体积（V）较高，糖苷的最佳面积（a）较小，使得CPP高于颗粒污泥LPS，从而导致了较少的聚集结构。根据文献发现，如果聚集结构为层状，则CPP≈1；如果为反转结构，则CPP>1；如果为球形，则CPP<1。本研究也能得出相同的结论，即絮凝污泥CPPLPS>颗粒污泥的CPPLPS。
【凝胶影响】
LPS占提取EPS总有机质约15%-25%，占比较高。作为两亲分子，LPS在水溶液中可以形成多种聚集结构，，这些聚集结构可能通过钙离子桥接脂质A的相邻磷酸基团从而实现稳定。LPS-Ca化学结构和形态可能会影响EPS-Ca的性质，显然，紧凑的双层多层结构有利于形成能够自我维持紧密结构，如颗粒污泥EPS-Ca。而相反的是，反转结构在聚集体之间水相阻碍了分子间的紧密排列，而停留于流动性结构，这种结构无法自我维持，如絮凝污泥EPS-Ca。此外，脂肪酸是脂质的组成部分。通常，不饱和脂肪酸具有较低的熔点，在室温下呈液态。相比之下，饱和脂肪酸更紧密地堆积在一起，具有较高的熔点；高比例的不饱和脂肪酸可能会增加絮凝污泥EPS-Ca流动性。
04、主要结论
脂多糖（LPS）作为细胞外聚合物（EPS）中重要糖脂成分，占絮凝污泥和颗粒污泥EPS约15%~25%。絮凝污泥LPS含有较少的糖苷、较短的糖苷链长度、较低的分子量，并且很可能含有不饱和脂质，因此，LPS-Ca表现为反转结构，这使得絮状污泥EPS-Ca具有类似液体的性质。相比之下，颗粒污泥LPS-Ca具有显著不同的化学结构，展示了双层多层形态，赋予了EPS-Ca固体胶状特性。本研究对进一步理解EPS性质以及开发基于EPS产品提供了重要依据和启示。
