温东辉教授团队：污水处理厂尾水排放对受纳水域微生物群落的影响
摘要：污水处理厂（WWTPs）是连接物质的社会循环和自然循环的枢纽。现代WWTPs能够去除污水中的大量污染物，但是残留污染物及菌体仍随排水进入自然环境，对受纳水域造成很大干扰。微生物驱动着物质的生物地球化学循环，受纳水域的微生物群落是响应排水干扰的先锋生物。从群落结构、响应策略、致病菌与抗生素抗性传播3个方面总结了WWTPs尾水排放对受纳水域微生物群落的影响。尾水排放显著改变了受纳水域的微生物群落结构；微生物群落通过改变营养利用策略与种间关系以响应排放干扰，使污染物代谢功能在微生物群落中富集。尾水是向水环境输入致病菌与耐药菌的重要点源，也在一定程度上促进了致病菌与抗生素抗性在微生物群落中的传播。充分理解WWTPs排水对受纳水体微生物群落的影响，是开展WWTPs排水管理和健康风险控制的科学基础。
研究背景
污水处理厂（WWTP）是支撑城市化与工业化发展的重要基础设施。以生物处理法为核心运行的WWTP去除了大部分市政污水及工业废水中的污染物，使得达标排放尾水的环境影响被大大降低。但受限于目前的处理技术，尾水中依然存在一些残留污染物。随着排放量的日益增大，携带残留污染物的尾水成为影响受纳水体环境质量不可忽视的因素。
微生物群落在生物地球化学循环过程中扮演着不可或缺的角色，受污染生境中生态系统的稳定也离不开群落对污染物的转化和代谢作用。微生物群落作为响应污染的先锋，可以快速响应污水处理厂尾水的排放干扰。因此，微生物群落成为了评价尾水受纳水域环境承载力与生态环境健康的重要媒介。随着组学技术的发展，研究者们可以利用测序技术抓取群落中几乎所有物种的基因信息。通过生物信息学与微生物生态学的交叉研究，尾水受纳水域中微生物群落的多样性、结构组成、功能性状等得到了揭示；不同强度、污染特征的尾水与受纳水域微生物群落间的响应关系得到了解析；威胁生态健康安全的潜在致病菌与抗生素抗性问题得到了重视。为了系统评价尾水排放的环境影响以及受纳水域环境对尾水的承接能力，本文从微生物群落的结构组成、响应策略及群落驱动的健康风险3个方面梳理了尾水排放对受纳水域微生物群落的影响规律，并指出未来还需加强微生物群落对排水中新污染物的响应、复合污染情境下群落的响应策略和健康风险评估等方面的研究。
01 污水处理厂尾水排放
对受纳水域环境的影响
为了支撑现代城市化和工业化的发展，污水处理厂（WWTPs）的处理量和负荷与日俱增。WWTPs大部分出水（即尾水）被直接排放到自然水体中，成为地表径流和近海水域的重要组成部分。在一些地表径流体系中，尾水贡献占比甚至可以达到80%。近年来我国污水排放量不断上升，2022年全国城镇污水处理厂的总处理量为626亿 m3，污水处理率达98.11%。污水处理量主要集中在沿海省份（图1），这也使得WWTP排放成为地表水环境和近海环境的典型人为干扰因素。
图1 2022年全国污水排放量与WWTPs污水处理量
目前WWTPs需要处理的污水有2种类型，工业废水（industrial wastewater）与市政污水（municipal sewage）。市政污水的来源与成分相对简单，但是随着药物和个人护理品（PPCPs）等人工合成有机物的广泛使用，市政污水中也出现了诸如PPCPs、溴代阻燃剂等新型污染物，虽然它们大多为微量/痕量的浓度水平，但却难以被常规处理工艺有效去除，且会随着尾水排放对受纳水域产生持续性的影响。工业废水的来源与成分复杂多样，有着显著的行业特征，并常含有很多有毒有害的难降解污染物，如染料行业废水中的偶氮类、芳香胺类有机物，石油化工行业污水常含有大量长链烃类物质及其衍生物，医药生产行业废水中含有大量抗生素、止痛剂等药物及其转化产物。目前工业普遍采用园区化发展模式，园区内不同类型工业废水采用分散与集中的联合方式进行处理，工艺也远比市政WWTP的流程更复杂，但其出水中仍然会同时存在传统污染物以及新污染物的残留。Wang等在中国25 座WWTP的出水样品中就检测到有机磷酸酯类污染物（OPEs），主要包括有机磷酸二酯与有机磷酸三酯。Schaefer等在38 座WWTP的出水中检测到平均浓度为(80±24) ng/L的全氟和多氟烷基化合物（PFAS）。
高负荷的污水处理需求和现有处理技术的局限性影响了WWTPs尾水的特性。作为自然水体的重要补充，尾水排放将对受纳水体的生态环境产生显著影响。通过化学指纹图谱分析，Liu等揭示了在电子、钢铁等行业废水排放影响下受纳河流的有机微污染物，有84 种污染物在受纳河流中被识别，包括农药或医药中间体、食品添加剂、增塑剂、阻燃剂、杀虫剂、PPCPs、染料。Wang等对WWTP的河流-湖泊整个受纳体系的研究结果表明，水体的可溶解性有机物（DOM）种类与浓度的改变与WWTP排放的DOM息息相关。本研究团队对中国杭州湾的2 个典型尾水受纳区域（北岸的嘉兴纳污区与南岸的上虞纳污区）开展了系统性研究。其中，嘉兴纳污区主要受市政排放影响；而上虞纳污区主要受工业排放影响，因其沿岸分布有包含染料、制药产业的化工园区。虽然沿岸的WWTP尾水均达到GB18918—2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》，但持续性排放依旧改变了纳污区的环境特征。Dai等通过水质比较，确定COD、硝酸盐为2个纳污区的主要污染物，PCA显示了不同尾水排放影响下2个受纳水体之间也产生显著环境差异。不仅如此，2个纳污区的沉积物中都检测到了相当量的可吸附有机卤化物，且上虞纳污区[(76.3±21.9) mg/kg]的含量显著高于嘉兴纳污区[(37.5±9.8) mg/kg]，体现了上虞近岸水体受化工尾水排放影响的特点。
02 尾水排放对受纳水域
微生物群落结构的塑造
在采矿技术与化工合成技术发达的今天，各类污染物输入给环境微生物群落带来了极大的选择压力。能够降解和代谢污染物的功能类群被定向筛选，导致群落结构与组成也产生了与污染特征相呼应的改变。例如2010年墨西哥湾的“深水地平线”原油泄露事件，导致附近海域沉积物中富集了石油烃降解物种Gammaproteo bacterium（γ变形菌）与Colwellia（科维尔氏菌），石油烃等碳氢化合物成为构建群落的主要驱动力。与突发污染事故不同，WWTP尾水排放是污染水平低、持续时间长的点源，其输出的污染物也会对受纳水体的微生物群落结构与组成产生影响。有研究报道了在尾水排放的影响下，群落中相应的功能优势物种丰度显著提高。如Wang等比较了城市面源、农业面源、郊区面源以及WWTP点源排放对太湖沉积物微生物群落的影响，发现WWTP排放对微生物群落结构产生的影响与面源不同，优势群落由Proteobacteria（变形菌门）和Firmicutes（厚壁菌门）向Nitrospira（硝化菌）和Bacteroidetes（外源化合物降解菌）转变。受纳水域微生物群落结构的改变则反映了尾水排放的环境干扰足迹。
1. 微生物群落多样性的变化
多样性是微生物群落结构的重要特性之一，诸如通过Shannon、Chao等群落多样性指数的变化可以直观地反映群落结构在各种干扰下的变化。一般认为，排放干扰所带来的生态位过滤作用会降低受纳水域的群落多样性。Wang等研究了湟水河中受市政排放干扰水域的浮游微生物群落结构，结果显示尾水受纳水域的α多样性（Chao指数：511.52±287.45，Shannon指数：4.79±0.73）显著小于其他水域（Chao指数：1155.73±250.04，Shannon指数：6.11±0.42），推测原因是市政WWTP的尾水排放显著提高了受纳水域的抗生素与硝酸盐浓度，驱使群落结构向同质化方向发展。类似地，在Dai等的研究中，杭州湾南岸的上虞纳污区群落物种丰富度与α多样性显著低于北岸嘉兴纳污区，因为上虞纳污区接纳了尾水中更多的有毒有机物，其微生物群落的选择压力更大。然而，排水干扰下群落多样性也有升高的情况。如Price等在美国桑迪河及其支流的WWTP尾水排放口附近发现群落Shannon指数与Chao指数相比于其他水域群落有显著上升，并且增加的物种中有一部分参与了群落的营养循环，这与WWTP是研究区域主要营养盐（NO3-、PO43-、SO42-）来源的排放特征相吻合。Tao等认为尾水中的有机物、营养盐等若被视为营养输入，其创造的生态机会可能比生态位过滤效应更为显著，因此，排放干扰强度与微生物群落结构变化之间存在复杂的、非线性关系；他们通过建立WWTP尾水排放干扰下的沿海沉积物微宇宙系统，研究了不同尾水比例影响下的微生物群落结构变化；随着尾水占比增加，发现总有机碳和总氮含量也不断升高，群落多样性（Shannon指数与Simpson指数）出现先降低、后增加的现象；当尾水占比达到100%时，群落多样性相比原始群落有了显著提升。
微生物群落多样性的变化对外源污染物的输入有一定的指示作用。群落多样性指数降低还是升高，取决于输入物质的生物可利用性与生物毒性。群落多样性降低指示着污染物胁迫带来的生态位过滤效应占据主导地位；而多样性升高意味着输入污染物多为可被微生物利用的有机物、营养盐，为更多物种创造了生态机会。
2. 微生物群落组成改变与特征物种
受纳水域微生物群落组成在WWTP尾水排放干扰下发生改变。能够耐受污染胁迫、进而降解和代谢污染物的功能类群微生物在群落中的丰度升高，而对污染胁迫敏感的物种丰度下降，因此功能类群微生物与污染物敏感物种皆为能反映排放影响的特征物种。近年来，许多研究者都在各自研究情景下观察到受纳水域微生物群落组成的变化，识别到受排水影响的特征物种。
首先，能够降解和代谢尾水中残留污染物的功能类群微生物在受纳水域中有着显著的生存优势。从门水平上看，Proteobacteria、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Actinobacteriota（放线菌门）等成为受干扰水环境中的优势类群。Proteobacteria也是WWTP活性污泥的主要微生物门类，其在生物处理技术中发挥了重要作用；Cai等在河流生态系统中发现的针对双酚A和壬基酚的降解菌也属于Proteobacteria门。Actinobacteriota门是典型的聚异戊二烯降解菌，可以分泌乳胶透明蛋白（lcp），有效裂解异戊二烯双键。Bacteroidetes门的微生物具有降解高分子量有机物的能力，在尾水样品中也常被检测到很高丰度。值得注意的是，仅从门水平观察物种组成，难以对功能类群做出准确判断，也难以体现尾水排放对群落影响的特征。在欧洲多瑙河、美国密西西比河、日本多摩河和南非阿皮埃斯河流的研究中，均发现占比不同的Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria，但均为高丰度微生物门。因此在研究尾水排放影响下的功能类群时，需要深入到更细化的物种分类水平。
表1整理了更细化物种分类水平下纳污水域中有关功能类群微生物的研究，表明功能类群微生物与WWTP排放的污染特征有着很强的相关性。例如，早期Drury等研究发现，芝加哥城区WWTP显著提升了受纳水域的DOC含量，群落中的Sphingobacteriales（鞘氨醇杆菌目）显著上升；Sphingobacteriales被发现有利用农药、抗生素等复杂有机物的能力。之后，Atashgahi等研究了比利时1条受氯乙烯污染的富营养化河流，该河流在WWTP建成与运行之后，富营养化情况得到缓解，河流DO含量提升，与DO含量呈正相关的Burkholderiales（伯克氏菌目）和Xanthomonadales（巴氏黄单胞菌目）丰度显著增加；两者都具有降解顽固有机物的能力。近年来，Wang等研究发现，WWTP排水导致湟水河抗生素含量上升，河水及沉积物的微生物群落具有抗生素抗性，优势微生物Acinetobacter（不动杆菌属）可以降解多种有毒物质。另外，不可忽视的是，污水处理系统的出水本身就含有较多的功能微生物。受纳水体中的功能类群有一部分可能来自WWTP排水的贡献。Brion等考察了巴黎塞纳河沿岸的3个不同工艺的污水处理厂排水，发现其均含有比自然环境更高丰度的硝化菌群，尾水排放使塞纳河受纳水域的微生物硝化作用效率提升。
表1 在门下物种分类水平识别的受影响水域特征物种
其次，受排水影响的特征微生物不仅有优势功能类群，还包括难以耐受排水污染物的敏感物种。近年来这方面研究也开始增加，如表1所列。Ruprecht等利用人工设置的排放浓度梯度（即排水混合比例），从压力-应激源-响应的角度探索了WWTP排放对群落结构组成的影响，发现随着排水比例增加，硝酸盐含量升高使得不耐受硝酸盐的敏感物种hgcI_clade（归属放线菌门）丰度显著下降。Tamminen等在瑞士的4条溪流中研究了尾水排放对生物膜微生物群落的影响，发现除草剂阿特拉津、绿麦隆等与细菌群落间有显著的响应关系；3种不同的Rhodobacter（红杆菌属）与上述微污染物都存在显著负相关。除草剂对光合作用有抑制效应，可能由此干扰了Rhodobacter的光合作用生存形式。需要说明的是，通常微生物群落中存在着难以耐受有毒污染物及高营养盐的敏感物种，如多数细菌会受到有害重金属的抑制毒害作用。但就尾水排放影响而言，在现行WWTP排放标准（GB18918—2002）下，污水处理后尾水的重金属含量通常很低，在μg/L水平，因此也鲜有研究关注WWTP排水中的重金属对水环境中微生物群落的影响。
目前大部分研究关注有显著生存优势的功能类群，只有少数研究关注难以耐受污染物的敏感物种。污染物敏感物种能更直接地反映排水中污染物对微生物的毒害抑制作用，因此，同时关注群落中的优势功能类群与污染物敏感物种可以更为全面地指示尾水排放的环境影响。目前的相关研究主要围绕市政污水排放，而工业废水排放对微生物群落影响的研究很少。工业废水中含有更多种类的有毒物质，也更有可能造成群落中敏感物种的丧失；另一方面，从工业废水排放干扰下的群落中更有可能筛选出降解和代谢复杂有毒污染物的功能菌种。
03 受纳水域微生物群落
对尾水排放的响应策略
1. 群落功能响应
WWTP尾水排放造成的环境微生物群落功能结构变化与其抵抗干扰的特征功能有关（图2）。在尾水受纳水域中，与有机污染物降解、营养盐代谢相关的功能基因也会相应富集。Jeffries等研究了悉尼港口湾区的浮游微生物群落的功能结构，发现悉尼港湾区承接了大量的市政排水，湾区微生物群落的氮磷代谢、碳氢化合物降解的功能通路得到了充分富集。Meziti等关注了接受尾水排放的Kalamas河在排放口附近以及河口的功能基因差异，发现在排放口附近，芳香烃化合物降解、磷吸收以及潜在工业来源的环烷酸降解基因有更高的富集，而在离排放口较远的河口区域则几乎检测不到这些功能基因。在Su等的研究中，对比了杭州湾受排放干扰区域、近湾以及远湾地区的功能组成差异，发现在受干扰区域间氨基苯甲酸、阿特拉津、二噁英等污染物的降解功能基因明显富集，群落中污染物降解和代谢功能的富集体现了其面对排水干扰带来的环境压力时表现出的适应性和抵抗性。此外，群落功能结构的改变也能体现尾水排放的污染输入特征。Li等利用宏基因组测序对受尾水排放影响的河流沉积物微生物群落的代谢潜力进行了全面探究。出人意料的是，在观察到直接受排水影响的沉积物群落中氮、磷、硫代谢功能基因占比提高的情况下，碳氢化合物代谢的功能基因却显著下降。可能的解释是WWTP排水带来了更多可被生物利用的物质，因此对于沉积物微生物群落而言，获取并代谢碳氢化合物不再是微生物生长的限速步骤。而在Wang等的研究中，排水影响区域的硝酸盐还原基因表达出现了显著下调，这可能是由于排水中碳源不足而硝酸盐过多，难以满足硝酸盐还原过程需要的碳氮比。可以看出，WWTP排水不仅使污染物降解和代谢相关功能基因得到富集，而且不同的污染输入特征也给微生物群落的功能结构带来了差异化的影响。
图2 排水干扰下微生物群落的响应策略
2. 营养策略
WWTP尾水排放显著改变了受纳水体的营养状态以及资源的可利用性，致使微生物对水体中有机质和营养盐的利用策略也随之发生改变。营养策略的转变也代表着微生物群落生存策略的调整。
生态学上常用r型策略者和K型策略者来描述微生物在不同营养环境中的生存策略。r型策略者rrn拷贝数高，细胞增殖速度快，对资源的利用效率低；K型策略者相反，rrn拷贝数低，增殖缓慢，但对资源的利用效率高。因此r型策略者常出现在生物可利用资源丰富的富营养区域，而K型策略者在贫营养区域占据优势地位。Dai等利用r-K选择理论评估了WWTP排水对微生物群落营养策略的影响，以曾被WWTP排水干扰过，以及未被WWTP排水干扰过的沉积物为研究对象，对2种沉积物微生物群落都进行了低/高营养盐浓度冲击，在受排水干扰群落中出现了更多的r型策略者，说明营养输入对r型策略者本身就有一定的偏好性；研究还发现，受干扰群落在营养盐冲击实验中表现出更强的稳定性（更低的群落更替速率）以及更高的多样性，说明r策略者的存在使得群落对于营养冲击有着更强的适应性与抵抗性。将实验室研究结果推至自然环境，r-K策略者的占比也从侧面反映了排水中残留污染物的生物可利用性。Wang等从水环境中可溶性有机质（DOM）组分的角度，考察了尾水排放为主要营养源的河流中的微生物群落，发现从直接受排放影响的上游到下游区域，微生物群落呈现从K型策略者到r型策略者的转变。根据DOM组分解析，上游受排水直接影响，河水含有较多生物可利用性较低的类腐殖质物质，在上游水域中，能利用这类难降解物质的K型策略者增多；而经过K型策略者的分解，以及类腐殖质物质在河流中的自然分解，下游水体中蛋白质类的生物可利用性物质增多，因此在下游水域中r型策略者逐渐增多。
3. 群落种间关系
群落中的微生物个体间存在着合作与竞争等复杂的种间关系。目前学界主要采用共现网络分析及相应的拓扑学结构参数来揭示物种之间的共存模式。共现网络中的正相关关系一般被认为是合作，负相关关系则被认为是竞争。网络复杂度被认为是微生物群落中种间联系的密切程度，即全部物种在物质代谢、能量流动与信息交换上相互作用关系的多样性。Dai等研究发现，在受人类活动影响显著的近岸沉积物区域，共现网络的复杂度要高于全球海水中的微生物群落，并且近岸群落中的优势种多呈正相关。在后续的营养添加实验中，随着营养盐的加入，群落中负相关比例提升，群落物种间的竞争性提升，这可以解释为在普遍贫营养的海洋环境中，种间合作可能是维持群落稳定、缓解多样性丧失的重要机制。但在受尾水排放等人为干扰的近海区域，营养盐的输入为优势种创造了更有利的生存条件，但同时也可能因优势种争夺更多资源而抑制了其他物种生长。Dai等在受市政排放影响的嘉兴纳污区也观察到了因营养输入使群落竞争性提升的现象，但是在上虞纳污区，以工业废水为主的近岸排放对受纳水域造成了很大的环境选择压力，此水域中微生物群落的网络复杂度降低，观察到较少的负相关。这是因为排放造成的强环境选择，淘汰了难以适应污染环境的非功能物种，而耐污的特征功能物种需要紧密的种间协作。由此可以看出，营养物质输入提升了群落的种间竞争；有毒物质输入提升了群落的种间合作。但网络中正/负相关关系的丧失，其实也意味着网络结构的不稳定，这表明排水干扰塑造了受纳水域微生物群落的网络结构。
网络的模块化也是WWTP排水影响下群落共现网络的典型特征。Zhang等发现，受尾水排放影响的清流河微生物群落中有明显的网络模块性，识别的网络模块与多环芳烃等有机物的降解、硝化-反硝化等氮代谢有关。不少研究者从微生物生态学角度对模块化进行了解释，Yuan等认为网络中的模块体现了微生物群落在人为干扰下产生的特征功能类群集合；Zhou等将网络模块解释为生态位或功能单位。群落的模块化可以解释为在排水干扰下原先的功能结构被改变，转而向污染物降解与代谢的特异性方向发展。
分析共现网络的拓扑学参数特征，为识别群落中的关键物种（keystone taxa）提供了重要线索。目前研究者常把具有高连接度与低介数中心度的节点物种定义为关键物种，关键物种对维持群落稳定及发挥群落功能起着重要作用。Guo等在对长江沿岸受排水干扰沉积物微生物群落的研究中，确定了属水平网络中的10种关键物种，包括Desulfobulbus（脱硫球茎菌属）、Methanosaeta（鬃毛甲烷菌属）、Nitrospira（硝化螺旋菌属）等。这些关键物种参与到硫酸盐还原、甲烷代谢、硝酸盐还原等关键代谢过程中。可见，在排水带来的大量营养物质输入下，群落中的关键物种对物质循环功能有着重要贡献。换一角度看，排水干扰水域中的关键物种也对群落响应污染胁迫起着重要作用。Zhang等在对受排水影响的清流河微生物群落的研究中，识别到Denitratisoma（脱氮球菌属）、Anaeromyxobacter（厌氧杆菌属）是网络中的关键物种，其中Denitratisoma包含了许多反硝化菌，Anaeromyxobacter包含金属还原细菌，对3群落响应重金属污染至关重要。
04 尾水排放影响下微生物
群落驱动的健康风险
1. 潜在致病菌的增殖
市政污水中含有人类生活废弃物（包括粪便、尿液等），其中致病菌、病毒随着尾水排放进入受纳水环境中，形成了较大的生态健康风险。Cai等开展了香港沙田污水处理厂出水致病微生物组的研究，识别到75种致病微生物属。早期研究者们常使用粪便指示细菌（fecal indicator bacterial，FIB）来描述水体受人类粪便的污染情况，FIB指在人畜粪便中含量较高、流入环境中可指示人畜污染来源和污染水平的细菌，如Escherichia coli（大肠杆菌）、Enterococcus（肠球菌）等，这些细菌在人畜粪便中广泛存在、易于培养、方便监测，特别是它们中很多是致病菌，故FIB被拓展为人类致病菌的替代指标。Pascual-Benito等发现，市政污水的排放显著增加了排放口附近水域的FIB浓度，标志着尾水排放带来的粪便污染，但在下游1km处水质恢复正常。他们结合之前的模型推导研究，认为是水体较快的自净作用削减了粪便污染菌，这也提示了研究者应该直接关注潜在致病菌的增殖。与此同时，越来越多的研究也表明，传统的FIB指标存在局限性。首先，虽然FIB浓度被证明与一些介水传染病密切相关，但随着越来越多的致病菌被发现和研究，FIB失去了代表致病菌的普适性。Harwood等指出：FIB不仅与Salmonella（沙门氏菌）、Giardia（贾第鞭毛虫）、Cryptosporidium（隐孢子虫）等致病菌无关，而且与一些肠道源病毒也不相关。其次，传统FIB选取的细菌不具备宿主专一性，在污染溯源时存在较大困难。随着克隆文库与组学技术的不断发展，研究者可以直接识别环境中存在的潜在致病菌。以Vibrio vulnificus（创伤弧菌）为例，这是海洋中的一种多宿主病菌，它可以感染人类和海洋中的动物。Okeyo等在南非的尾水受纳水域中发现了创伤弧菌的存在；而Correa Velez等利用转录组测序分析，在实验室环境中探索了市政污水排放对创伤弧菌增殖传播的影响，发现尾水排放显著改变了受纳水域创伤弧菌的生存模式，具体表现为胞内第二信使cyclic-di-GMP的显著上调，导致了创伤弧菌向生物膜形式增殖，这种生长模式的转变可能与污水排放的Ca元素相关。上述研究表明，尾水不仅向自然环境输送致病菌，其含有的金属元素等微生物代谢调节因子还可以改变环境中致病菌的生长模式，甚至促进其增殖，造成更大的环境风险。
2.抗生素抗性传播
1）抗生素残留输入。
目前抗生素在全球范围内被大量应用于医疗卫生和畜禽养殖行业，我国是抗生素的生产和使用大国，仅2013年我国的抗生素使用量就达到了16.2万 t。
由于人体对药物代谢不完全，收集与处理生活污水和医院污水的WWTP成为抗生素污染的集中地。目前，WWTP所使用的处理工艺难以将抗生素有效去除，因此尾水排放也就成为了自然环境中抗生素的重要来源。Zheng等整理了河口与近岸海域中抗生素的主要来源，在已有的相关研究中，发现近50%来自WWTP的抗生素排放。在中国香港的维多利亚海港，市政WWTP每天向海水中排放约14.4 kg的目标抗生素。在希腊雅典萨罗尼科斯湾的内湾区域，有着全欧洲第2大污水处理厂，承接湾区大量的市政污水，在湾区海水中检测到127.8 ng/L氨基青霉素。工业污染源同样不可忽视。如中国浙江上虞经济开发区拥有生产抗生素的制药企业，研究者对开发区WWTP排放水域的检测分析显示，工业废水尾水比市政污水尾水向杭州湾输入了更多的抗生素。
抗生素是微生物群落自然选择的推动力之一，自然界微生物会通过使抗生素失活、细胞外排泵、药物靶位点修饰等机制对环境中的抗生素产生固有的耐药性，这是存在于微生物基因组上的抗生素抗性基因（ARGs）所表现出的内在抗性。抗生素的滥用加速了该进程，目前在全球各环境中发现，携带ARGs的抗性细菌（ARB）在数量、多样性和抗性强度上都表现出了显著增大的趋势。
2）ARGs的传播。
尾水中残留的抗生素虽然在一定程度上促进了环境微生物产生ARGs，但这一过程较为缓慢，并且受到环境中抗生素浓度的制约。现代WWTP尾水中也残留微生物细胞和基因元件（包括ARGs），ARGs在环境中具有很高的移动性，可通过质粒、接合性转座子、噬菌体等可移动遗传元件（MGEs）转移，游离态的ARGs还可以直接被微生物摄入。相对来说，水平基因转移是ARGs传播扩散的主要机制。
较早期的研究借助培养实验以及定量PCR（qPCR），评估了尾水排放带来的ARGs输入。LaPara等借助qPCR，在美国明尼苏达州苏必利尔湖1座市政WWTP的尾水受纳水域中发现四环素类抗性基因的显著富集，尽管这座WWTP使用了三级污水处理方案，其仍然是ARGs的重要来源。Czekalski等在瑞士日内瓦湖中发现市政WWTP影响区域中sul1、sul2、tet(B)、tet(M)、tet(W)等抗性基因丰度是湖中心对照区域的200倍之多。其后，随着测序技术的发展，宏基因组测序也被应用到ARGs的研究中。宏基因组测序尽可能还原了环境样本的真实性，研究者不必关注于某几种特定的ARGs，从而可以更好地对WWTP出水以及受纳水体中的ARGs进行比较。Zhu等的研究揭示了河口沉积物中ARGs种类的丰富度与市政污水的输入有显著关系，认为WWTP是河口、沿海等自然环境中ARGs的污染来源。Chu等通过宏基因组测序以及距离衰减分析，发现WWTP排放口附近水域与出水样品中相同的ARGs有明显富集；同时携带这些ARGs的Helicobacteraceae（螺杆菌科）、Legionellaceae（军团菌科）等菌的丰度随着离WWTP距离增加而减少，可以看出尾水排放影响了受纳水体ARGs的组成与空间分布。当前随着宏基因组序列配合机器学习算法在分析上的深入，研究者们也对水体中的ARGs进行溯源分析，以明晰尾水排放对ARGs传播的具体影响。Su等通过source tracker分析对近岸纳污区中的ARGs进行了溯源，发现了源于WWTP活性污泥中的ARGs占比较高（14.3%），并分别评估了工业废水、市政污水与纳污区沉积物群落ARGs的水平转移潜力，发现工业废水的水平基因转移潜力更高。类似的，在Wu等的研究中，WWTP排放不仅贡献了受纳河流中约87.3%的ARGs，同时水平转移潜力也得到提升。由此可以看出，在WWTP排放的受纳水域中，MGEs在ARGs传播方面的作用不容忽视。在Raza等对WWTP出水和受纳水体ARGs及MGEs的研究中发现，由质粒介导的ARGs比例在出水样品中最高，这促进了受纳水体中ARGs的传播。因为质粒容易发生接合、转位和重组，从而跨越种间屏障，促进ARG的水平基因转移频率。噬菌体也促进了ARGs的传播，它们不仅是ARGs的关键环境储存库，而且可以通过转导在细菌中植入ARG。Chen等对常州尾水受纳水域的研究发现，受纳水体与人类粪便共同拥有14 种ARGs，意味着ARGs从人类粪便向受纳水体的迁移。这些ARGs与人类肠道源噬菌体crAssphage有着显著相关性，反而与环境中抗生素丰度无关。类似地，Raza等对韩国12座污水处理厂出水样品的研究，发现长期存在于所有采样点的持久性ARGs被Acinetobacter baumannii（鲍氏不动杆菌）等病原菌携带，并且噬菌体是出水中唯一的丰度与这些ARGs丰度相关的MGE。整合子也是重要的MGEs，其在ARGs传播中的作用，近年来受到研究者们的广泛关注。它是一种可移动的DNA分子，具有特殊结构，可捕获和整合外源性基因，特别是抗生素抗性基因、重金属抗性基因等，使之转变为功能性基因的表达单位，之后可通过转座子和质粒在细菌中水平传播。在目前发现的整合子类型中，有5种可以帮助ARGs的水平基因转移，其中对耐药基因传播机制的研究主要集中在I型整合子上。研究证明，Int I在在环境中的分布与污染物排放、人类活动强度有密切关系。在污水处理过程中，Int I通常难以去除，Du等的研究涉及5座使用不同处理工艺及来源市政污水的WWTP，在所有出水样品中都识别到了Int I的存在。在WWTP排水的受纳区通常发现Int I丰度的升高，同区域中携带Int I的细菌占到总群落的1%~10%。可以看出，WWTP也是环境中Int I的潜在来源，Int I增多也促进了ARGs在环境中的传播。
尾水排放对受纳水体其他理化性质的改变也可以影响ARGs的传播，其中典型的是重金属对抗性基因的协同筛选作用。抗生素抗性本身就是微生物抵御环境胁迫的手段，而重金属耐受基因与抗性基因通常在同一个遗传元件上共同出现。Devarajan等发现日内瓦湖维迪湾WWTP是附近水域重金属和ARGs的点排放源，同时在受纳水体中重金属也与ARGs显著相关。不仅如此，很多研究者发现消毒剂、洗涤剂等污染物对ARGs的筛选和水平转移具有不同程度的促进作用，而WWTP排放也是这些污染物的重要来源之一。环境中游离的ARGs并不会直接产生抗生素抗性的威胁，只有当它们进入细菌中并表达时才会导致抗性的集中出现。ARGs在环境中灵活的迁移机制也会导致其在一些致病菌中富集，导致本来就对人类和动物有健康威胁的病菌获得抗生素抗性，造成多重耐药性甚至超级细菌的出现，这有可能会使日后的临床药物治疗失效，给公共卫生安全带来极大的隐患。而WWTP排放同时输入了致病菌与ARGs，加大了这样的威胁。Tang等在工业废水受纳水域发现潜在致病菌和ARGs之间存在很强的共现性。
抗生素抗性风险近年来受到了研究者们的广泛关注。Zhang等结合了人类可接触性、ARGs移动性、宿主致病性以及临床有效性建立了耐药基因人类健康风险评估框架，这一综合多因素的评估框架可以较为全面地指示耐药基因的健康风险。由于WWTP排放使得纳污区的理化特征与一般自然环境有着显著差异，评估纳污区的耐药组风险就需要考虑WWTP的排水特征。Su等8]在评估耐药组风险时，结合工业废水的排放特征，加入了杀菌剂与金属抗性基因，与可移动遗传元件、毒力因子一同成为评估耐药组风险的指标。
05 总结与展望
当前组学技术的发展为微生物群落研究提供了更全面深入的技术平台，但是有关微生物群落与尾水排放之间的响应关系尚未被充分解析。未来还需从微生物群落对排水中新兴污染物的响应、复合污染情境下群落的响应机制、健康风险评估3 个方面深入探究尾水排放对受纳水体微生物群落的影响。目前相关研究中有关统计结果的定量描述较少，未来也需加强对受干扰水环境中微生物群落变化的定量研究。
1. 微生物群落对尾水中新污染物的响应
WWTP尾水中的污染物显著改变了受纳水域微生物群落的结构，导致群落中出现能够指示污染影响的特征物种。能够降解和代谢污染物的功能类群，如有机物降解菌、硝酸盐还原菌等有显著的生存优势，不耐受污染物的敏感物种丰度显著降低。目前对特征物种的研究还建立在对传统污染物的检测上，研究者们还不断发现有机磷酸酯、含氟化合物、微塑料等新污染物被排放到水环境中。但这些新污染物对微生物群落结构与功能有怎样的影响尚不明确。未来需继续推进对WWTP排水及受影响水域的污染物成分的高分辨解析，一些新污染物的检测还依赖非靶向筛查等新技术的支持。将新污染物的检测结果与微生物群落的响应相结合，就需要利用建立在组学数据基础上的统计分析方法。揭示微生物群落在排水中新污染物干扰下的结构与功能响应，一方面可指示新污染物的真实环境影响；另一方面可指导新污染物的环境管理与治理对策。
2. 复合污染情境下群落的响应机制
尾水中含有多种类型的污染物，受纳水体的复合污染情境也使得微生物群落的响应机制变得更为复杂。耦合代谢是微生物群落去除多种污染物的重要机制，例如微生物对难降解有机物的代谢可与反硝化、铁还原、硫酸盐还原和厌氧甲烷氧化等过程耦合。但目前研究者大多关注群落中污染物降解功能的富集与损失，很少开展群落的耦合代谢机制研究。组学技术在解析微生物群落驱动的元素循环及污染物降解代谢方面发挥了重要作用。宏基因组学可以揭示从群落到个体水平的微生物功能潜力。宏转录组能更真实地反映微生物群落的基因表达与调控情况。联合运用宏基因组学和宏转录组学，可以深入地揭示复合污染胁迫下微生物群落驱动的物质耦合代谢机制。尾水受纳区常被认为是WWTP的延伸，未被完全去除的污染物在纳污区微生物群落的降解代谢下可被转化和去除。对这一人工系统与自然系统衔接区域的微生物群落响应机制的清晰认识，可以为未来的WWTP排放管理提供理论支撑。
3. 健康风险评估
纳污区不仅在理化性质与群落组成上与一般自然环境有着显著区别，而且其致病菌与耐药组也会因WWTP输入而传播。目前有关受纳水域群落中ARGs的检出频率与丰度结果并不能直接指示抗生素抗性风险，还应考虑ARGs的移动性、人类可接触性和宿主致病性等因素，这方面目前还没有形成普遍认可的健康风险评估方法。WWTP尾水的受纳水域是环境因素、人类及动物活动的交汇区域，在如今Onehealth的理念下，应努力推进对这一特殊区域中病菌传染性与抗生素抗性传播机制的研究，以期更好地识别并管控排水驱动的生态健康风险。
