细菌及宏基因证明污泥并不产生藻酸盐
编者按：污泥胞外聚合物（EPS）作为一种具有高附加值回收资源备受关注。前期研究通过EPS化学成分分析，确认EPS中既不存在甘露醛酸、也不存在古鲁醛酸，它们的缺失证实EPS成分并不含有藻酸盐（往期链接）。但是否存在一种可能，即藻酸盐于污泥中合成，且是污泥絮体的重要部分，但它们在EPS提取过程被“遗弃”？或者，藻酸盐仅作为过程产物，在微生物代谢环节又被“消耗”掉了？。换句话说，EPS不存在藻酸盐，并不等同于污泥不产生藻酸盐。为彻底探明污泥系统是否会产生藻酸盐，研究从微生物角度出发，分析藻酸盐产生细菌和合成路径。结果证实，藻酸盐产生细菌的丰度极低，且其合成路径缺少部分关键基因操纵子！因此，研究从根本上确定了污泥基本不可能具有产生藻酸盐的能力。相关研究已于近期发表于《Water Research》。
整理 | 李季
责编 | 郝晓地
文章亮点
1、活性污泥中产藻酸盐相关细菌丰度极低
2、与藻酸盐表达的相关基因通路缺失部分关键操纵子
3、污泥龄 （SRT）对EPS产量和组成具有显著影响
4、低SRT可提高EPS产量，改变蛋白质和多糖组分
1. 研究背景
近年来，从活性污泥中回收胞外生物聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS）研究日益受到关注。EPS已习惯被称为类藻酸盐胞外聚合物（Alginate-like Extracellular Polymers，ALE）。但EPS是否含有藻酸盐仍是一个未知数。污泥EPS中藻酸盐存在必须归因于产藻酸盐细菌的活动以及参与藻酸盐生物合成的生化途径的表达。藻酸盐主要由褐藻产生，且仅有两种产藻酸盐的细菌属，即，假单胞菌属（Pseudomonas spp.）和固氮杆菌属（Azotobacter vinelandii）。这些细菌具有藻酸盐生物合成的特定遗传途径和酶，藻酸盐在胞内产生后释放成为胞外。
本研究采用高通量测序和宏基因代谢组学，探究活性污泥中细菌丰度和藻酸盐合成潜力。为扩大结论可靠性，在实验室通过控制BNR系统SRT，改变细菌种群和丰度，尽可能获得“全部”种群细菌。进一步提取不同周期内污泥EPS，并将与细菌信息相关联。本研究最终目的是鉴定污泥产藻酸盐细菌及其生物合成途径，并确定EPS中是否存在藻酸盐。
2. 主要结果
控制系统SRT由20 d逐渐降低至10 d ，保证每个工况下出水符合去除率要求后，继续稳定运行若干周期，收集每个周期内剩余污泥。利用高温碳酸钠法提取污泥EPS，结果显示，SRT=20 d时EPS产量最低105.0±6.0 mg/g VS污泥；随着SRT降低，EPS产量逐渐增加，在SRT=10 d时达到最大207.2±4.4 mg/g VS污泥。该范围与我们早期结果90~190 mg/g VS范围一致（往期回顾）。多糖和蛋白质含量结果见表1，官能团谱图见图1。
表1 不同 SRT 条件下的 EPS 产量及总糖和蛋白质成分
A:以葡萄糖作为标准，mg葡萄糖当量/g EPS（总固体）
B:以牛血清蛋白（BSA）作为标准，mg BSA当量/g EPS（总固体）
图 1 不同SRT条件下EPS傅立叶变换红外光谱
图2所示为不同SRT条件污泥的门水平微生物丰度。进一步定量分析了细菌丰度与EPS产量间关系，图2图例括号数值为相关系数，绿色和红色分别代表正相关和负相关。结果显示，变形菌门与EPS产量具有最强正相关性，R²高达0.74；酸杆菌门（Acidobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）与EPS产量呈显著负相关，R²分别为0.97和0.67。
图 2 不同SRT条件下细菌群落相对丰度（门水平）
藻酸盐仅由两类细菌产生，包括假单胞菌属Azotobacter vinelandii和固氮菌属Pseudomonas spp.。本研究发现假单胞菌属丰度介于2.53%~6.76%，固氮菌属丰度介于1.98%~6.34%，其种属丰度均较低。进一步宏基因组评估结果显示。藻酸盐合成关键调控编码Alg 44基因读取值非常低，仅约0.01‱~0.02‱。Alg 8操纵子比例也非常低，仅为0.05‱~0.11‱。除Alg 44和Alg 8外，参与藻酸盐合成的其他操纵子还包括AlgD、AlgG、AlgX、AlgK、AlgE等，结果见表2。均表明，污泥中与藻酸盐合成相关的基因簇水平极低。
更重要发现为：在所有SRT条件污泥均缺失AlgK基因，且SRT=20 d和SRT=15 d污泥也缺失AlgF基因。AlgK基因参与表达各种藻酸盐合成酶；AlgF基因在藻酸盐的O-乙酰化修饰中起着关键作用。文献也报告了类似发现，他们同样观察到在实际污泥中，藻酸盐合成代谢途径中缺失重要基因，这都表明藻酸盐并未能在污泥表达与合成。
表 2 部分藻酸盐合成基因相对丰度值
图 3 藻酸盐操纵子基因的存在/缺失
3. 重要结论
SRT改变对细菌多样性和丰度具有显著影响，较低的SRT显著可提高EPS产量。利用高通量群落细菌鉴定发现，产藻酸盐细菌Pseudomonas spp.和Azotobacter vinelandii在总细菌种群中所占比例较小。宏基因结果显示，与藻酸盐合成相关的代谢途径和酶活性相对较低，且缺失部分重要基因。结合前期化学成分分析结果，基本可以断定污泥不具备产生藻酸盐能力，EPS中更不可能存在藻酸盐。
