剩余污泥EPS中类藻酸盐/ALE物质新解
编者按
近十年来，剩余污泥胞外聚合物（EPS）“类藻酸盐”（ALE）聚合物因潜在高值资源化而备受关注。之前，人们把从EPS中提取到的一种粘性聚合物物定义为ALE，因为其化学结构有点像海洋大型褐藻（海带）表面的凝胶（藻酸盐）成分。然而，越来越多研究显示ALE成分并非完全与海藻藻酸盐尽相一致。因此，需要微观深入研究ALE的真实“身份”，以揭示ALE的化学结构本质。研究收集了2个污水处理厂活性污泥并首先提取EPS，同时，采用部分酸化法将EPS分离为不同区块。通过深入分析各区块单糖组分，特别是构成藻酸盐的基本单元甘露醛酸（mannuronic acids）和古鲁醛酸（guluronic acids）后发现，EPS并不存在这些单糖组分，表明污泥EPS实际并不含有藻酸盐（alginate）结构。该研究结果进一步发现EPS存在脂多糖（lipopolysaccharide）成分。该成果已于近期发表《ACS ES&T Water》杂志。
文章亮点
1、首次直接确定污泥胞外聚合物（EPS）中并不含有藻酸盐（alginate）物质成分。
2、首次提出并证明EPS中含有脂多糖（lipopolysaccharide）结构
1、研究背景
胞外聚合物（EPS）为污泥絮体提供结构支撑，在污水生物处理环节至关重要。许多研究对其EPS组成和化学结构深入剖析。2010年，林等人采用从褐藻中提取藻酸盐的方法提取污泥EPS，借鉴FAO/WHO公布的生物聚合物鉴定方法，并结合光谱分析，证明了EPS与藻酸盐有相似特性，故将EPS命名为“Alginate-like exopolysaccharides” (ALE，后更为“alginate-like exopolymers”)，认为EPS是商业藻酸盐的潜在替代品。自此，EPS/ALE获得持续关注，截至2024年3月，大约有70篇论文将污泥EPS与ALE联系（基于Web of Science搜索，关键词sludge和alginate-like-）；甚至其中40多篇论文直接认定ALE就是藻酸盐。
将ALE完全视为藻酸盐可能会限制ALE拓展研究，特别是揭示新组分、了解理化性质和挖潜高值材料/产品。故此，定论ALE等同藻酸盐之前，回答“从污泥中提取的ALE是否含有藻酸盐成分?”问题至关重要。
2、主要结果
活性污泥的EPS产量分别为167.6±18.4 mg/g和179.5±1.5 mg/g (VS)，二者蛋白质和多糖含量相近。部分酸解法分离结果显示尽管每个区块含量略有不同，但两组EPS均含有大量的蛋白质。藻酸盐实质为多糖聚合物，区块中较高的蛋白质意味着化学成分角度EPS区块不同于藻酸盐。
图1 EPS及其区块多糖和蛋白质分析与物质平衡
采用HPAEC-PAD测定各区块单糖组分。在酸性糖检测区，所有藻酸盐均呈现两个糖单体峰，即古鲁醛酸和甘露醛酸峰。而所有EPS区块在此附近均没有出现糖峰。这充分表明EPS中并不含有这两种糖单体；它们是组成藻酸盐的基本单元，意味着EPS不可能含有藻酸盐结构。
图2 HPAEC-PAD分析单糖谱图
图3 不同EPS区块单糖组分
为进一步了解EPS多糖结构，计算糖单体摩尔比并在“bacterial carbohydrate database”搜索，结果显示沉淀于乙醇的F-I大部分是脂多糖的O抗原，可溶于乙醇的S-I是脂多糖的糖核。官能团分析显示F-I中几乎没有脂质相关峰；而S-III在 2,920 cm-1和2,850 cm-1处出现明显强峰，，它们归因于脂质的-CH2基团的拉伸振动。在1,460 cm-1和1,230 cm-1处存在脂质A峰，在1,050 cm-1处存在多糖峰，说明EPS中极可能含有脂多糖。
图4 不同EPS区块与藻酸盐FTIR谱图
研究继续对该脂多糖lipopolysaccharide (LPS)开展研究。采用加热苯酚-水提取方法从EPS中分离出LPS，其提取量分别为20.5±0.8%和23.5%±1.0%（VS）。LPS红外谱谱分析表明其含有明显的脂多糖结构。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示两种LPS呈现典型阶梯状荧光带，这是LPS内O抗原具有的重复单元聚集所致。LPS提取和染色实验验证了EPS中LPS的存在。
(a)
(b)
图5 LPS傅里叶红外图谱和SDS-PAGE染色
图6 LPS典型结构示意图
3、研究讨论
“无”藻酸盐
近十年来，越来越多污泥EPS研究集中在“ALE”，开展化学分析，表征提取组分，但没有直接证据表明藻酸盐存在于ALE/EPS。本研究结果显示EPS没有发现藻酸盐的两种基本糖单体，这直接确定了活性污泥提取EPS不含藻酸盐结构。也有相关文献报道描述了EPS与藻酸盐的不同之处；最近关于污泥中海藻酸盐生物合成基因表达研究也显示海藻酸盐产生基因仅限于少数低丰度的细菌（基于23个丹麦活性污泥样本宏基因组）；而基因操作子结果发现只有一个污泥样本具有完整的藻酸盐合成操作子，另外两个污泥样本缺少超过5个重要操作子（总数12个）。结合这些研究可以断定，污泥存在藻酸盐的可能性很低。术语“类藻酸盐”(ALE)仅是反映EPS具有与藻酸盐相似特性，即，与钙离子反应可形成凝胶，但不代表其化学结构。
“有”脂多糖（LPS）
细菌合成多种单糖或寡糖，通常附着在蛋白质(糖蛋白)和脂质(糖脂)上，或者直接聚合形成多糖。SDS-PAGE凝胶显示特有阶梯状条带，证实EPS中存在LPS。LPS是一种两亲性糖脂分子。疏水脂质A嵌入细胞外膜，连接脂质A外端是核心糖区和O型抗原。O型抗原由20-70个单糖聚体重复单元组成。脂质A中存在的磷酸基团和其他阴离子基团使LPS可溶解于碱性环境并最终被提取。部分酸解过程，O抗原从LPS剥离，这种多糖结构会在高浓度乙醇中聚集沉淀；而脂质A+LPS的核心糖区呈疏水特性，则会溶解于乙醇。因此，溶解于乙醇的S-III的显示出较强的脂质特性。
LPS是一种阴离子型聚合物，其每个分子至少具有6个负电荷基团。这种阴离子特性可能促进了与钙离子发生的凝胶反应，这就解释了误解EPS含有藻酸盐之根源。
当前关于EPS中多糖研究多集中于自由分子多糖；除此外，糖蛋白和糖脂也属于糖基化合物。因此，更全面的EPS多糖研究需考虑除多糖外的其他糖蛋白和糖脂结构和功能。
4、主要结论
活性污泥提取到的EPS糖单体组分确定了EPS中并不含有甘露醛酸和古鲁醛酸，这意味着EPS中并不含有藻酸盐结构。研究进一步表征鉴定，脂多糖(LPS)应该是EPS化学结构中的重要组成部分。因此，利用化学成分分析进而直接验证物质组分对EPS研究至关重要。
