彭永臻院士团队：不同聚集形态短程反硝化耦合厌氧氨氧化系统脱氮性能与碳源利用特性
研究背景
厌氧氨氧化（Anammox）技术因其经济高效与低碳绿色等特点被认为是目前极具应用前景的生物脱氮技术。然而实际污水处理过程中，因其电子受体亚硝态氮（NO2--N）的缺乏导致其应用严重受阻。而随着短程硝化（PN）和短程反硝化（PD）的研究开展，Anammox技术有了重大突破。与短程硝化耦合厌氧氨氧化（PN/A）相比，短程反硝化耦合厌氧氨氧化（PD/A）具有更深刻的意义，例如：理论上可以实现100%脱氮率，稳定高效的NO2--N来源等。
碳源类型是影响PD过程的重要影响因素，而实际污水处理过程中，也常常因碳源类型的复杂性导致反硝化受影响及出水效果差的问题。不同碳源驱动反硝化的过程中，不仅会影响反硝化的速率，也会影响NO2--N的积累情况，例如，以乙酸钠为碳源可以实现在10 min内完成80%以上的NO2--N积累量，并且不会发生NO2--N的还原。在以葡萄糖为碳源的研究中发现NO2--N积累能力较乙酸钠系统明显下降，之前研究表明，以葡萄糖为碳源快速启动PD/A工艺，总氮（TN）去除率可达到88.3%，硝态氮（NO3--N）转化为NO2--N的比率（NTR）为63.5%。除此之外，牛萌等利用甲醇为碳源，启动并实现了稳定的PD过程，在C/N（COD/NO3--N）为2.5的条件下实现了高达89%的NTR。而以乙醇同样可以作为反硝化的碳源，并且出现NO2--N的积累，孙洪伟等人发现以乙醇为碳源时的NO2--N积累速率（15.8 mg/L·h）快于乙酸钠（9.3 mg/L·h）。碳源的类型与C//N都能引起短程反硝化过程的改变，之前的研究集中于某一种碳源作为该系统的电子供体，尽管利用同一种碳源，不同的系统间也会产生巨大的差异。而探究同一系统利用不同碳源的能力和碳氮转化规律十分必要，对于指导实际污水处理过程的调控有十分重要的意义。
同时，Anammox因其生长周期长，对外部环境变化十分敏感等特点，导致其持留问题显得十分重要。目前，形成颗粒污泥或外部添加载体形成生物膜的方式被认为是有效持留Anammox菌的手段。明晰不同生物聚集状态下的系统长期运行情况，系统性地探究其对不同碳源的利用情况，明确不同系统的功能菌差异具有指导实际意义。
因此，本文研究了4℃条件下厌氧保存的PD/A污泥以两种方式进行工艺重新启动的脱氮性能，即投加生物载体的生物膜系统和颗粒污泥系统两系统进行长期试验；另一方面，以批次试验探讨了两系统稳定运行时，碳源类型和C/N对不同培养模式下耦合菌群短程反硝化与厌氧氨氧化反应的影响。
摘 要
考察了微生物以生物膜和颗粒污泥两种聚集方式主导的短程反硝化耦合厌氧氨氧化（PD/A）系统启动与长期运行性能、功能菌活性变化与种群结构差异。通过批次试验研究了不同碳源类型和碳氮比（C/N）对不同聚集形态的PD/A污泥脱氮活性的影响。结果表明，PD/A生物膜与颗粒系统均实现了氨氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3--N）的同步高效稳定去除，总氮（TN）去除效率分别为90.6%和96.2%。碳源类型对PD过程实现亚硝态氮（NO2--N）积累具有显著影响。当C/N为5.0时，生物膜系统比NO3--N还原速率（μNO3）由大到小依次为乙酸钠、葡萄糖、乙醇和甲醇，在C/N为3.0时，生物膜系统比NH4+-N降解速率（μNH4）由大到小依次为葡萄糖、乙醇、乙酸钠和甲醇；在适宜C/N范围内，厌氧氨氧化活性随短程反硝化活性提升而提高；当乙酸钠为碳源时，颗粒污泥系统表现出较高的短程反硝化活性；但改变碳源后，颗粒污泥系统反硝化活性低于生物膜系统。因此，针对不同聚集形态活性污泥系统，选择适宜碳源类型及C/N对PD/A工艺稳定运行具有重要作用。
01、试验部分
1. 试验装置
本试验采用有效容积均为10.0 L的序批式（SBR）反应器构建短程反硝化耦合厌氧氨氧化（PD/A）生物膜系统和颗粒污泥系统。其装置如图1所示。利用支架将填料固定于反应器内部。生物膜反应器采用圆柱体结构的聚乙烯空心环填料（直径2.5 cm，高1.2 cm，密度低于1 g/cm3，比表面积为500 m2/m3）。
2. 试验水质
本试验用水为人工合成废水，通过向自来水中加入一定质量的氯化铵（NH4Cl）和硝酸钠（NaNO3）以分别提供氨氮（NH4+-N）和NO3--N，用以模拟NH4+-N与NO3--N废水；分别加入硫酸镁（MgSO4）、氯化钙（CaCl2）、磷酸二氢钾（KH2PO4）等配制的储备液提供矿物质和微量元素。微量元素配方见表1。
3. 批次试验
批次试验在有效容积为0.5 L的反应装置中进行。试验开始前向装置中通入氮气3~5min以保证反应系统中维持缺氧环境，减少溶解氧对微生物活性的影响。进行批次试验时，反应器中取出一定体积的颗粒污泥或一定数量填料的生物膜，并用蒸馏水清洗2~3次后加入批次试验装置内，按照不同时间间隔用注射器取泥水混合液，取样体积约为10~15 mL，经中速滤纸过滤后进行相应指标的检测。
4. 高通量测序分析方法
本研究采用16S rRNA基因扩增引物分为两种：338F（5’- ACTCCTACGGGAGGCAGCA -3’）， 806（5’- GGACTACHVGGGT W TCTAAT - 3’）用于V3和V4区扩增；515F (5’- GTGCCAGCMGCCGCGG -3’)，907R (5’- CCGTCAATTCMTTTRAGTTT -3’) 用于V4 和V5 区扩增。本研究中采用的高通量测序利用Illumina Miseq PE300平台进行。允许的密码子最大错配数量为0，引物最大错配数为2。去除无效序列及嵌合体后，得到有效序列用于OTU分类分析，相似度为97%，采用Usearch进行分析。根据测序深度和OTU数量得出稀释曲线，采用Mothur进行稀释曲线和Shannon曲线绘制。将得到的全部OTU与Silva数据库比对，在门和属进行不同分类学水平菌群结构分析。
表1 合成废水矿物元素和微量元素配方
02、结果与讨论
1. PD/A生物膜系统启动与强化脱氮性能
以聚乙烯空心环填料为载体的SBR系统共长期稳定运行154d，整个运行过程共分为5个阶段（表2）。阶段I（1~19d）为系统的启动阶段，启动初期系统的脱氮效率并不高，平均出水NH4+-N和NO2--N浓度分别为99.79 ，56.98 mg/L，剩余NO3--N仅为1.16 mg/L（图1），说明反硝化菌活性恢复较快，而厌氧氨氧化菌脱氮活性仍较低。此阶段平均NH4+-N和TN去除率仅有36.8 %和49.6 %。此时，填料上还未形成良好的生物膜，厌氧氨氧化菌处于适应期，反硝化脱氮作用占比较大，厌氧氨氧化脱氮途径占总氮去除的62.8%，远低于之前研究中PD/A系统近90%的贡献率。为降低底物积累（NO2--N）对厌氧氨氧化菌的抑制作用，阶段II中将进水NH4+-N和NO3--N浓度分别降低至72.80 ，78.09 mg/L。发现出水NH4+-N和NO2--N浓度迅速降低，NH4+-N和TN去除率分别提高至82.5%和90.6%，表明PD/A生物膜系统启动成功，同时观察到填料上有大量生物膜形成。为加快填料挂膜驯化，实现AnAOB的富集和持留，从阶段III至阶段V，采用逐步增加进水基质浓度的方法，提高系统氮负荷，同时根据脱氮效率调控C/N和HRT以优化系统运行，出水中仅有少量NH4+-N剩余，TN去除率均在90%以上，说明以生物膜系统进行PD/A工艺的启动在50d内可实现短程反硝化与厌氧氨氧化的耦合脱氮。通过优化运行能够实现较高脱氮效率，厌氧氨氧化对TN去除的贡献率由62.8%提高到86.6%，说明厌氧氨氧化菌活性逐渐提高，在脱氮过程中占主导地位，且对基质竞争能力不断得到强化。
表2 PD/A生物膜反应器长期运行条件
图1 生物膜系统长期运行效果
2. PD/A颗粒污泥系统启动与强化脱氮性能
将接种污泥投加到无填料的颗粒污泥SBR系统，考察污泥脱氮性能的恢复和长期运行稳定性。启动初期颗粒污泥系统进水与生物膜系统一致。启动后发现出水NH4+-N逐渐升高，说明厌氧氨氧化活性较低，未得到快速恢复（图2）。出水NO3--N也不断积累，表明短程反硝化活性也未快速恢复。随着系统运行，20d后系统出水NO3--N不断降低，NO2--N浓度逐渐升高，同时NH4+-N仍有较多剩余，表明此时短程反硝化过程在逐渐恢复，但厌氧氨氧化活性仍未得到完全恢复。运行40d后，NH4+-N和NO2--N逐渐降低，总氮去除率逐渐升高，最终达到95%以上。第60~154天的平均TN去除率为96.2%，厌氧氨氧化脱氮贡献率达到88.7%，均高于生物膜系统，在未降低进水氮负荷的条件下实现了PD/A的恢复启动与稳定运行。
以上结果表明，以生物膜系统进行PD/A工艺启动，短程反硝化表现出高活性，随着降低进水浓度，降低NO2--N对厌氧氨氧化过程的抑制，厌氧氨氧化过程慢慢恢复，并在长期运行中形成PD/A生物膜；在颗粒污泥系统进行工艺启动时，短程反硝化活性需要一定恢复时间，当短程反硝化恢复较高活性后，厌氧氨氧化活性得到逐步恢复。由此可见，以生物膜和颗粒污泥进行PD/A恢复启动的脱氮性能差异主要原因在于短程反硝化活性的恢复。功能菌群的空间分布对系统短程反硝化特性具有重要影响，推测生物膜结构有助于异养菌利用胞外聚合物和微生物代谢产生的有机物进行异养代谢，当环境条件变化时，不同异养菌可能存在协同作用，使反硝化NO3--N还原过程受环境影响减小。相比之下，颗粒污泥系统中微生物多样性较低，在环境条件改变时，优势菌群对运行环境的适应性对脱氮性能有较大影响。
图2 颗粒污泥系统长期运行效果
3. 不同碳源下PD/A生物膜与颗粒污泥系统的碳氮转化特性
为探究碳源类型和碳氮比对不同PD/A污泥培养模式下短程反硝化和厌氧氨氧化反应的影响，分别以甲醇、乙醇、乙酸钠和葡萄糖为碳源，在C/N分别为1.5，3，4和5的条件下，展开针对生物膜系统及颗粒污泥系统的批次试验。
1）以甲醇为碳源的PD/A碳氮转化特性。
当采用甲醇为碳源时，在C/N为1.5~5条件下生物膜和颗粒污泥PD/A反应均未进行完全（图3），且反应过程中NO2--N积累峰值较低。在生物膜反应过程中，C/N为1.5，3，4和5时，最大NO2--N积累浓度分别出现在反应第90 min（2.39 mg/L），60min（1.57 min），40 min（2.42 mg/L），和30 min（2.35 mg/L）。在颗粒污泥反应过程中， NO2--N积累峰值都出现在反应第60 min，浓度分别为1.12，1.11，0.85，0.73 mg/L。这说明短程反硝化过程受到一定抑制，主要是由于甲醇具有一定生物毒性，而PD/A反应系统长期在乙酸钠为有机碳源条件下运行，微生物并未完全适应甲醇为碳源。然而，整个反应过程中NH4+-N均呈不断下降趋势，厌氧氨氧化反应并未被完全抑制，在C/N高达5.0时仍具有较高厌氧氨氧化脱氮活性，说明PD/A反应在甲醇为碳源时仍具有一定的抵御生物毒性影响能力。
图3 以甲醇为碳源的批次试验
2）以乙醇为碳源的PD/A碳氮转化特性。
对比甲醇为碳源的结果，以乙醇为碳源条件下PD/A过程氮素转化活性高于以甲醇为碳源时的活性。如图4所示，当C/N=1.5时，反应结束时仍有NO3--N剩余，但随着C/N逐渐升高（C/N=3,4,5），NO3--N逐渐反应完全并伴随着NO2--N的积累，最大积累浓度较甲醇为碳源时出现大幅升高，平均可以达到10 mg/L。由于NO2--N的积累浓度升高，厌氧氨氧化活性得以提升，出现NH4+-N和NO2--N同步降解的趋势。但有趣的是，在生物膜系统较低C/N（C/N=1.5，3）下，前40 min并未观察到明显的NO2--N积累，但NH4+-N和NO3--N出现同步下降的趋势，同时COD在前5 min被快速消耗，说明短程反硝化产生的NO2--N直接被厌氧氨氧化菌利用。
图4 以乙醇为碳源的批次试验
3）以乙酸钠为碳源的PD/A碳氮转化特性。
乙酸钠是污水生物处理过程中常用到的有机碳源之一，其可以快速实现反硝化过程中NO2--N的积累。如图5e所示，当C/N为1.5时，反应在15min达到NO2--N积累峰值，随后由于缺乏电子供体，NO3--N不再被还原，NH4+-N与NO2--N通过厌氧氨氧化作用得到去除。当C/N提高至4.0时，生物膜系统和颗粒污泥系统中最大NO2--N积累浓度分别提高至26.54 ,29.05 mg/L，反应末期无NO3--N剩余。提高C/N后，反硝化速率加快，同时发现厌氧氨氧化速率同样加快，这与前期研究结果一致，即短程反硝化速率的提高促进厌氧氨氧化氮素转化活性升高。但过高C/N将导致积累的NO2--N被反硝化菌消耗。在C/N为5.0时，积累的NO2--N在反应第120min时完全消耗，而剩余的氨氮由于缺乏厌氧氨氧化过程底物而未被完全去除。
此外，C/N为4和5时NO2--N积累均在30 min时达到峰值，说明再继续增加C/N对提高短程反硝化速率的意义并不大，反而使产生的NO2--N被反硝化还原，因此，对于乙酸钠为碳源的PD/A生物膜工艺，通过控制较低的C/N有利于系统的稳定维持。
图5 以乙酸钠为碳源的批次试验
4）以葡萄糖为碳源的PD/A转化特性。
葡萄糖为易生物降解的大分子有机物，研究结果表明，以葡萄糖为碳源时均出现NO2--N积累，但积累浓度随C/N的增加并不明显，最高NO2--N积累浓度平均在10 mg/L，远低于乙酸钠为碳源。这主要是由于葡萄糖为碳源时反硝化速率远低于乙酸钠为碳源时反硝化速率。但短程反硝化NTR始终维持在较高水平，C/N为1.5~5.0范围内的平均NTR达到90%以上，说明葡萄糖能够作为PD/A系统适宜碳源。此外，不同C/N条件下厌氧氨氧化活性在整个反应过程中维持稳定，在C/N为5.0的条件下反应结束时剩余的氨氮浓度最低。这主要是由于以葡萄糖为碳源时反硝化速率较低，厌氧氨氧化反应速率与其差距更小，有利于厌氧氨氧化菌争夺底物亚硝态氮。由此可见，不同碳源类型对短程反硝化速率影响差异较大，间接影响厌氧氨氧化与反硝化作用的活性平衡，从而造成脱氮效率的差异，实际工艺运行过程中，可以针对不同处理水质与系统，通过选择适宜的碳源和C/N，实现PD/A工艺高效脱氮。
图6 以葡萄糖为碳源的批次试验
4. 不同聚集形态下PD/A系统碳源利用特性与活性变化
1）生物膜系统的碳源利用特性与活性变化。
针对不同碳源条件下生物膜系统反应速率进行计算，研究和分析了碳源对PD/A生物膜系统微生物活性的影响。试验结果表明，不论是何种碳源，随着C/N增加，比硝态氮还原速率（μNO3）皆逐渐增加，C/N由1.5增加至5.0时，甲醇系统μNO3由1.59 mgN/(gVSS·h)升高至11.04 mgN/(gVSS·h)，低于乙醇系统（由3.47 mgN/(gVSS·h)升高至14.59 mgN/(gVSS·h)），低于葡萄糖系统（由3.33 mgN/(gVSS·h)，乙酸钠系统反硝化活性最强，C/N为5.0时，可达到35.67 mgN/(gVSS·h)。
而厌氧氨氧化活性在不同碳源下表现出差异，甲醇系统中，随着C/N升高，μNH4也逐渐升高，厌氧氨氧化活性升高，消耗NO2--N的能力增强，导致μNO2变化不明显[由0.96 mgN/(gVSS·h)升高至3.03 mgN/(gVSS·h)]；乙醇系统中，C/N>3.0后μNH4逐渐降低，最终C/N为5.0时μNH4为2.64 mgN/(gVSS·h)，碳源充足使得反硝化有充足的电子供体将NO2--N异养还原为N2；乙酸钠系统呈现出与乙醇系统相似的现象，低C/N条件下厌氧氨氧化活性较高， C/N为1.5时μNH4达到5.73 mgN/(gVSS·h)；以葡萄糖为碳源时， C/N为3.0时厌氧氨氧化活性最高，μNH4达到8.47 mgN/(gVSS·h)，高于另外3种碳源的反应系统最大厌氧氨氧化活性，说明以葡萄糖能够作为PD/A生物膜系统的适宜有机碳源。
2）颗粒污泥系统的碳源利用特性与活性变化。
相比之下，以乙酸钠为碳源时PD/A颗粒污泥氮素转化活性高于生物膜系统（图7e—h）。随C/N升高短程反硝化速率增加，μNO3由31.26 mgN/(gVSS·h)升高至51.93 mgN/(gVSS·h)。乙酸钠为碳源的PD/A颗粒污泥具有最高的亚硝态氮积累效率，μNO2由22.73 mgN/(gVSS·h)增加到41.83 mgN/(gVSS·h)，高于生物膜系统。推测这主要与颗粒污泥系统中具有短程反硝化特性的功能菌丰度较高有关。然而，以甲醇、乙醇、葡萄糖为碳源时，颗粒污泥活性均低于生物膜系统。推测这与生物膜与颗粒污泥微生物种群结构有关，生物膜上生长了能够利用甲醇、乙醇和生物大分子等有机物的异养菌，而颗粒污泥长期在乙酸钠为碳源的反应器中培养，可能使得短程反硝化功能菌群得到定向富集，具有快速利用甲醇和大分子有机物的菌群相对丰度较低，表现出反应速率较低。
5. 不同聚集形态下的微生物种群结构特性
在生物膜系统和颗粒污泥系统稳定运行期间，取生物膜和颗粒污泥样品进行高通量测序技术对微生物种群结构进行分析。如图7所示，微生物种群α多样性分析表明， Shannon指数分别为5.02和3.89，生物膜系统微生物多样性高于颗粒污泥系统，推测生物膜具有更多种类的异养菌，使得较颗粒拥有更强的多类型碳源利用能力。
两系统的优势菌门均为Bacteroidetes，其在颗粒系统中占比达到42.42%，但在生物膜系统中占比较颗粒系统相比更低，为28.25%，除此之外，Proteobacteria菌门丰度占比也较高，其为污水处理系统中常见菌门，大多数为能够利用有机物进行代谢的异养菌，在生物膜系统中占比达到23.77%，在颗粒系统中占比达到27.68%。同时发现，Chloroflexi菌门在系统中相对丰度也较高，分别为18.70%和13.33%，该菌门包含大量丝状菌，其对于颗粒污泥和生物膜的形成有重要的作用。Anammox菌所在的Planctomycetes菌门在生物膜系统和颗粒系统中分别占到4.37%和2.35%。
图7 不同系统中微生物多样性及种群结构
在属水平上分析发现两系统的种群结构差异较大，其中生物膜系统的优势菌属为norank-f-Saprospiraceae（10.37%）、Thauera（7.68%）、A4b norank（5.61%）和NS9 marine group norank（5.51%）。颗粒污泥系统的优势菌属为norank-f-Saprospiraceae（19.27%）、Thauera（15.56%）、norank_o__SJA-15（11.15%）、norank_f__PHOS-HE36（10.47%）。之前的研究表明，在乙酸钠为有机碳源的短程反硝化系统中，Thauera菌属占较高比例，推测其在NO3--N还原并且产生较高NO2--N积累的过程起到关键作用。在本研究中，颗粒污泥系统中Thauera菌属丰度比生物膜系统中高近1倍，这也解释了以乙酸钠为碳源的试验中，颗粒污泥系统表现出强于生物膜系统的反硝化活性，但发现在该研究中检测到的Anammox菌（Candidatus Brocadia）丰度却是生物膜系统（0.66%）高于颗粒污泥系统（0.07%），推测为生物膜系统中存在的其他反硝化菌能与Anammox菌共生，例如Ignavibacterium，之前的研究表明，其为Anammox的常见伴生菌，在生物膜系统中的丰度可达3.73%，在颗粒系统中仅为1.41%，同时，也表明通过添加载体形成生物膜适宜anammox菌的持留和生长。
03、结论
本研究考察了基于生物膜与颗粒污泥的PD/A系统长期脱氮性能、微生物活性变化及种群结构差异。探究了不同碳源条件下PD/A系统氮素转化规律，主要结论如下：1）生物膜与颗粒污泥PD/A系统均实现NO3--N和NH4+-N同步高效去除，进水NO3--N和NH4+-N分别为155.68，155.34 mg/L，TN去除率分别为90.6%和96.2%。2）分别以甲醇、乙醇、乙酸钠和葡萄糖为有机碳源均能够实现短程反硝化为厌氧氨氧化均提供基质，反应速率随C/N升高而增加，C/N为5.0时，生物膜系统μNO3由大到小依次为乙酸钠、葡萄糖、乙醇和甲醇，而颗粒系统μNO3由大到小依次为乙酸钠、乙醇、葡萄糖和甲醇。3）不同碳源类型条件下不同聚集形态PD/A污泥的短程反硝化与厌氧氨氧化活性有显著差异，适宜C/N范围内，PD/A生物膜与颗粒污泥的厌氧氨氧化活性随短程反硝化活性提高而增大，但过高C/N将导致厌氧氨氧化反应速率降低。4）在适宜C/N条件下，生物膜系统μNH4由大到小依次为葡萄糖、乙醇、乙酸钠和甲醇，颗粒系统μNH4由大到小依次为乙酸钠、乙醇、葡萄糖和甲醇。5）颗粒污泥系统中Thauera菌属丰度比生物膜系统中高近1倍，是颗粒污泥系统反硝化活性高于生物膜系统的主要原因。此外，生物膜系统厌氧氨氧化菌群丰度高于颗粒污泥系统，推测生物膜系统更有利于厌氧氨氧化菌的生长和富集。
