活性污泥中聚磷菌/聚糖原菌内源衰减特征探究
编者按：承接往期对微生物内源过程的研究，本期继续剖析活性污泥中聚磷菌（PAOs）与聚糖原菌（GAOs）的内源衰减特征。本文通过实验分别定量BNR系统与PAOs富集序批式反应器（SBR）系统中PAOs，以及GAOs富集SBR系统中GAOs的衰减特征。结果表明，由细胞死亡引起的PAOs数量衰减在两个系统中分别占细胞总衰减的42%（BNR）和20%（SBR），而由细胞活性降低引起的活性衰减分别占细胞总衰减的58%（BNR）和80%（SBR）。在富集GAOs系统中，由细胞死亡引起的GAOs数量衰减仅占细胞总衰减的26%，而由细胞活性降低引起的活性衰减占GAOs细胞总衰减的74%。由此可见，PAOs/GAOs的数量衰减在其细胞总衰减中只占较小一部分，而绝大部分衰减是由活性衰减所引起。本文发表于《Biotechnology and Bioengineering》（2010年6月）。
整理 | 朱开宇
责编 | 郝晓地
文章亮点
1、细菌衰减是微生物内源过程的重要组成部分，包含由细胞死亡引起的数量衰减和由细胞活性降低引起的活性衰减两部分；
2、根据LIVE/DEAD细胞染色技术和FISH定量方法，确定PAOs/GAOs在富集系统中的死亡速率，根据PRR和VFAUR分别确定PAOs和GAOs细胞总衰减速率；
3、导致PAOs/GAOs细胞衰减的第一因素是活性衰减，其次才是细胞死亡。
前言
作为微生物内源过程（可参阅往期内容《污水物处理系统中微生物内源过程》）的重要组成部分，细胞衰减通常作为细菌应对不利生存状态时的策略，以减少能量需求、维持种群生存。定量分析以揭示细菌衰减特征对生物营养物去除（BNR）工艺的稳定与运行具有重要意义，特别是硝化菌、聚磷菌（PAOs）与聚糖原菌（GAOs）。相比于硝化菌，PAOs/GAOs相关研究量少且缺乏实验测定。基于此，本文通过测定磷酸盐（PO43--P）释放速率（PRR） 、挥发性脂肪酸摄取速率（VFAUR），以及荧光原位杂交技术（FISH）及LIVE/DEAD细胞染色技术，从细胞死亡和活性衰减两部分对二者的衰减特征进行较为完善的定量分析。旨在加深对活性污泥系统中PAOs/GAOs衰减特征的认识。
01、主要装置与实验
1.1 BNR中试系统
研究利用改良UCT中试系统培养PAOs，如图1所示。该系统总工作体积为326 L，平均处理水量为420 L/d，水力停留时间（HRT）为18 h，污泥龄（SRT）为35 d，所处环境温度为23~25 ℃。该系统稳定运行时的混合液悬浮固体（MLSS）浓度为 3910 ± 40 mg/L。系统进水采用实际污水（COD=300 mg/L、TP=5 mg/L、TN=52 mg/L）。
图1 实验室中试BNR工艺流程（来自原文）
1.2 PAOs/GAOs富集SBR系统
研究利用厌氧-好氧交替SBR系统富集PAOs/GAOs。反应器工作体积4 L，工作周期6 h，每天运行4个周期，以人工模拟污水作为进水，进水组分如表1所示。SRT=12 d，HRT=12 h。不同的是，PAOs富集SBR系统（PAO-SBR）运行温度为22.0 ± 0.5℃，pH=7.50 ± 0.05；GAOs富集SBR系统（GAO-SBR）运行温度为30.0 ± 0.5℃，pH=7.00 ± 0.05，并且以乙酸作为唯一碳源，并降低进水中磷酸盐含量，促进GAOs的生长。最终，PAO-SBR与GAO-SBR系统中MLSS分别为2845 ± 35 mg/L和3120 ± 40 mg/L。
表1 系统进水组份（来自原文）
1.3 细胞衰减实验及衰减速率测定
PAOs和GAOs衰减速率测定分别依靠衰减过程中最大PRR变化速率和最大VFAUR变化速率来确定。由于BNR系统中 PAOs与GAOs之间会发生VFA竞争，且系统稳定运行情况下往往前者占据竞争优势，故仅在GAO-SBR系统中测定GAOs衰减速率。
根据在衰减过程中测定所得PRR和VFAUR，依据公式（1）和线性回归方法，分别计算确定PAOs和GAOs衰减速率。
式中，b表示PAOs/GAOs的衰减速率（d-1），Rt为细菌衰减后最大PRR、VFAUR（mg/L/h），R0为细菌衰减前最大PRR、VFAUR（mg/L/h），td为衰减时间（d）。
需要注意的是，本研究中衰减速率是在细菌处于7 d饥饿状态条件下所测定的。这与活性污泥系统中细菌实际生存条件存在着一定差异（实际一般不可能在如此长时间内处于内源状态）。所以，本研究所测定的衰减速率可能与实际活性污泥系统中PAOs/GAOs原位衰减速率存在一定差异。
1.4 LIVE/DEAD染色及FISH实验
此外，还采用荧光染料对衰减过程中泥样染色，以确定泥样衰减过程中活细菌细胞占总细菌细胞比例的变化规律。以及利用FISH技术确定PAOs/GAOs在各自系统中所占比例。
02、结论与讨论
2.1 PAOs/GAOs衰减速率测定
PAOs/GAOs活性变化趋势如图2所示。PAOs/GAOs活性在整个衰减实验过程中呈线性平稳下降趋势，分别为0.113 ± 0.006 d-1（BNR）、0.181 ± 0.020 d-1（PAO-SBR）和0.132 ± 0.012 d-1（GAO-SBR）。测定值与其他通过数学模拟所得研究结果相吻合。
其中，BNR与PAO-SBR系统中测得的PAOs衰减速率存在略微差异，可能是由于两系统运行的SRT不同所致（BNR系统SRT=35 d；SBR系统SRT=12 d）。长SRT系统可能更易选择出能适应饥饿状态的菌种以应对不利环境时能够迅速做出紧迫反应，从而导致衰减速率降低。此外，PAO-SBR与BNR系统进水水质不同必然会导致两系统污水中噬菌体、病毒、原生动物及后生动物数量不同。这些因素共同导致两个系统中PAOs衰减速率出现差异。
此外，需要注意的是，PAOs/GAOs代谢过程均涉及胞内物质（如糖原）的转化。这些物质含量的变化可能会影响衰减速率的测定结果。因此，测量的活性变化可能不完全是由于细胞酶活性的降低，而是部分与底物的可用性有关。然而，我们发现VFAUR和PRR均随时间呈线性反比关系（如图2所示）。这表明由于胞内物质减少造成的影响在实验中并不显著。
图2 衰减状态下细菌活性变化（a. BNR系统；b. PAO-SBR系统；c. GAO-SBR系统）（来自原文）
FISH图像分析结果如图3所示。结果表明，在衰减过程中，PAOs和GAOs平均比例并没有出现突然变化（p>0.05）。并且在GAO-SBR系统中，PAOs量<2%，几乎没有检测到PAOs。因此各系统的PAOs与GAOs平均比例如表2所示。
图3 PAOs/GAOs占各系统中总活生物量比例（a. BNR系统；b. PAO-SBR 系统；c. GAO-SBR系统）（来自原文）
表2 衰减过程中各系统PAOs和GAOs的平均比例（来自原文）
2.2 PAOs/GAOs死亡速率测定
依据 MLVSS，FISH以及LIVE/DEAD（图4）测定结果，按公式（2），可计算衰减过程中死亡规律，结果如图5所示。根据线性回归方法，可计算出BNR系统和PAOs富集SBR系统中PAOs死亡速率，以及GAOs富集SBR系统中GAOs死亡速率，如表3所示。
式中，XA为活PAOs/GAOs浓度（mg/L，以COD 计），M为混合液挥发性悬浮固体，即MLVSS（mg/L），F是活菌PAOs/GAOs与总活菌的比值，即FISH测定结果，L为活细菌占总细菌的比例，即LIVE/DEAD测定结果。
图4 衰减过程中活细菌比例变化规律（a. BNR系统；b. PAO-SBR 系统；c. GAO-SBR系统）（来自原文）
图5 衰减过程中PAOs/GAOs衰减过程中死亡规律（a. BNR系统；b. PAO-SBR 系统；c. GAO-SBR系统）（来自原文）
表3 衰减过程中各系统PAOs和GAOs的死亡速率（来自原文）
2.3 细胞死亡和活性衰减的差异
根据上述所得PAOs/GAOs衰减速率和死亡速率，可进一步计算出PAOs/GAOs数量衰减（细胞死亡）和活性衰减对细胞总衰减中的贡献，结果如表4所示。结果表明，PAOs/GAOs绝大部分衰减是由活性衰减引起的，数量衰减只占其中较小一部分。这一内源特征显然是由其自身代谢方式特点所致，即，PAOs/GAOs在内源过程初期主要采取紧迫反应来应对不利环境条件，程序化细胞死亡（PCD）在内源过程初期并不是主要应对方式。此外，PAOs在厌氧阶段外源底物充足时能够迅速贮存外源底物，形成胞内聚合物（如PHA）。在随后好氧衰减过程中，PAOs可以依次分解体内的PHA、Gly和其它细胞物质来获取用于细胞维持的能量。GAOs的代谢途径与PAOs类似，因此，活性衰减在很大程度上导致了GAOs活性的降低。可见，上述综合因素导致了PAOs/GAOs在内源过程中衰减主要表现为活性的降低而不是细胞死亡。
实验结果表明，目前大多有关细菌衰减的研究因不能区分数量衰减和与活性衰减，而采用一个总衰减系数表示细菌衰减的方法不够科学，应当予以修正。例如，现有活性污泥数学模型将细胞衰减均假设为由细胞死亡所引起。可见，若不对模型参数（衰减系数）适当修正，势必导致模拟结果与实际情况出现一定偏差。
表4 衰减过程中各系统PAOs和GAOs的细胞死亡和活性衰减比例（来自原文）
结论
1）细菌衰减是微生物内源过程的一个重要组成部分，可分为由细胞死亡引起的数量衰减和由细胞活性降低引起的活性衰减两部分。这一认识应在污水生物处理技术的工程应用中得到足够重视。
2）根据衰减过程中磷酸盐释放速率（PRR）变化，计算确定的BNR和PAO-SBR系统中PAOs衰减速率分别为0.113 d-1和0.181 d-1。根据衰减过程中挥发性脂肪酸摄取速率（VFAUR）变化，计算确定的GAO-SBR系统中GAOs衰减速率为0.132 d-1。
3）根据LIVE/DEAD细胞染色技术和FISH定量方法，确定出BNR和PAO-SBR系统中PAOs死亡速率分别为0.048 d-1和0.036 d-1，其数量衰减占细胞总衰减的比例分别为42%和20%。GAO-SBR系统中GAOs死亡速率为0.034 d-1，其数量衰减占细胞总衰减的比例为26%，PAOs/GAOs数量衰减只占其细胞总衰减的较小一部分，绝大部分衰减是由活性衰减引起的。
