饮用水管网中抗生素抗性细菌/基因的赋存与控制
导读：当前,抗生素抗药性在环境中的蔓延已成为全球性的公共安全问题,世界卫生组织已将其列入21世纪威胁人类健康的最重大挑战之一。
区别于传统污染物,ARGs具有明显的生物学特征,其在环境中的传播依赖于细菌增殖,如亲代与子代之间的垂直基因转移或相同/不同菌株、种属间整合子、转座子,以及质粒等可移动遗传元件的接合、转导与转化,即水平基因转移以及基因突变等。这导致环境中的ARB/ARGs难以直接控制,从而被认定为新污染物。大量研究显示,水源水、地下水、污水处理厂、饮用水厂以及龙头水中均含有不同程度的ARB/ARGs。
水是人类的生命之源,而饮用水管网系统(drinking water distribution system,DWDS)作为饮用水输送过程中的最后一环,若不对ARB/ARGs加以控制,其最终会通过饮用水进入人体肠道,增强肠道中的细菌耐药性水平,从而对人体健康构成威胁。因此,为更好地去除DWDS内的ARB/ARGs,本文将在介绍DWDS中ARB/ARGs来源与赋存的基础上,重点阐述影响其赋存的重要因素,深入解析了与ARB/ARGs控制有关的切实可行技术,并对今后的研究内容与方向进行展望。
一、DWDS中ARB/ARGs的来源与赋存
已有研究表明,ARB/ARGs的赋存往往与抗生素的检出浓度存在明显相关性。为此,研究人员对我国南方某水源地所在水库中含有的典型抗生素进行调查,结果检出8种抗生素残留,其质量浓度为1.20～130.00 ng/L。Yan等进一步对长江流域5类20种抗生素进行时空分布测定,结果显示,除磺胺嘧啶外,其他抗生素均有检出,且以甲砜霉素和磺胺吡啶抗生素占比最大,最高质量浓度达到110 ng/L与219 ng/L。可见,水源水中抗生素的存在为ARB/ARGs的出现提供了条件。研究人员进一步对美国某社区饮用水厂水源水中ARB/ARGs进行检测,发现有携带四环素ARGs tetA与磺胺类ARGs sul1的多重抗药性细菌。同样地,在检测杭州某饮用水源中E.coli分离株对于抗生素敏感性试验时发现,大多数分离株都具有四环素耐药性,其次是氨苄西林、哌拉西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑和氯霉素。目前,水源水中普遍存在着ARB/ARGs。
水源水污染直接导致了饮用水厂中ARB/ARGs频频检出。Pruden等采用定量PCR(quantitative PCR, q-PCR)技术对美国某城市饮用水处理厂中ARGs进行检测,结果显示,水厂进水与出水过程中均有四环素类ARGs tetO和tetW检出。Guo等对长江三角洲附近的7个饮用水处理厂进水中磺酰胺ARGs sulI、sulII和四环素类ARGs tetC、tetG、tetX、tetA、tetB、tetO、tetM、tetW进行检测,发现其丰度大于105 copies/mL,且出水中仍有不同水平的ARGs检出。作为新污染物,目前尚未对ARB/ARGs去除有针对性的举措,这直接导致了出厂水中ARB/ARGs的存在。
当饮用水进入分配系统后,通常需要花费数小时甚至数天才能在管道内到达家庭龙头处,这期间复杂的物理与化学变化将进一步导致水质变化。研究表明,大部分DWDS水中ARGs含量要高于水厂出水和饮用水源地中的ARGs含量。张练等对DWDS中抗生素浓度的分布情况进行调查发现,其浓度呈现出先减弱后增加的趋势,DWDS末梢中抗生素浓度集中,检测到了四环素类抗生素、氯霉素类、大环内酯类抗生素以及林可霉素。Ateba等对南非某DWDS中异养菌进行分离培养测定,也发现大多数菌株具有多重抗药性,其中检测到包括strA、strB 21、dfrB 13、aadA 11、blaCTX-M 5以及tetA 3等在内的多种ARGs。目前,已通过高通量q-PCR测序技术对实际DWDS中ARGs进行检测,发现超过100种ARGs,其总含量为105～1010 copies/L。进一步研究发现,与出厂水相比,自来水中ARGs的富集倍数为6.4～109.2,尤其是β-内酰胺酶ARGs,由平均值1.08×107 copies/L上升至5.12×108copies/L。综上,DWDS是ARGs增殖的重要贮存库(表1),需要引起人们的重点关注。
表1 DWDS中ARB/ARGs的来源与赋存
二、影响DWDS内ARB/ARGs赋存的因素
微生物安全是饮用水安全的基本要求,为此有关部门出台了国标《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2022)、上海地标《生活饮用水水质标准》(DB 31/T 1091-2018)、深圳地标《生活饮用水水质标准》(DB 4403/T 60-2020)等一系列标准以保证水质安全,但细菌的抗生素抗性是近年来出现的新问题,且无论是ARB还是ARGs,均种类繁多,因此,这些标准均未涉及到饮用水ARB和ARGs的限值。DWDS中ARB和ARGs的普遍存在是不争的事实,且DWDS内的独特生存环境一定条件下会影响ARB/ARGs赋存和传播能力。
2.1水质特征
通常,当有环境压力(抗生素、重金属)存在时,ARB往往比敏感型细菌更有生长优势,但细菌通过改变细胞膜通过性、抗生素灭活、外排泵,以及改变靶位点等方式获得抗性的同时,不仅影响正常的生理代谢,而且会额外消耗物质与能量,导致其在没有选择压力时与敏感菌竞争处于劣势。而这一现象被称为细菌的适应度代价。一直以来,水体中抗生素浓度往往处于痕量水平(ng/L),但管网内却出现了高水平的ARB/ARGs。研究表明,饮用水所具有的典型环境特征在此过程中起到了重要作用,其中典型条件之一就是总有机碳(total organic carbon,TOC)浓度,其可以改变细菌对抗生素的表型耐受性。在贫营养条件下(TOC<0.05 mg/L),与野生型细菌相比,ARB的适应性代价将降低,即耐药细菌变得更具竞争力。Paulander等的研究也有力地证实这一观点,其发现较低的TOC浓度不利于RNA聚合酶σ因子(σS)的诱导,这将更有利于抗性菌的生长。在此基础上,Wan等通过中试试验探究了不同TOC浓度下饮用水砂滤系统中ARB/ARGs的赋存与维持,结果显示TOC浓度与ARB/ARGs丰度呈显著负相关,且低TOC水平更有利于ARG高多样性以及高丰度的维持。以上结果均表明,DWDS内低浓度TOC是影响ARB/ARGs赋存的重要原因。
2.2消毒工艺
为了保证饮用水的微生物学安全性,自来水在出厂前都要经过消毒工艺处理。目前最常用的消毒剂是氯和氯胺。为了保证管网中细菌生长得到有效抑制,我国的饮用水标准中对DWDS末梢水的消毒剂余量也做了规定,例如余氯质量浓度不应低于0.05 mg/L。但实际上,DWDS中残留的消毒剂并不能完全抑制细菌的生长。且由于消毒工艺所用种类、剂量以及接触的时间不同,对ARB/ARGs赋存的影响也不尽相同。据报道,当水体中游离氯浓度较低时,可以观察到多重耐药菌P.aeruginosa的生长,但当其质量浓度升高达到0.3 mg/L后,经过长期暴露包括ARB在内的所有细菌都将失活。研究人员对比了不同消毒剂对DWDS中ARB的影响,发现氯胺消毒在去除含有磺酰胺抗性的细菌时表现优异,游离氯则对四环素和β-内酰胺酶类ARB的去除更有优势。当紫外线(UV)光照强度达到200～12477mJ/cm2,ARGs的数量可下降2.48～4个数量级,UV会促进DNA中环丁烷嘧啶二聚体的形成,从而导致ARB失活。
目前,氯消毒由于效果优良、操作简便、价格低廉,在DWDS内得到了最为广泛的运用。研究显示,高剂量条件下,游离氯将破坏ARB细胞壁,并进入细胞质与DNA反应而使ARGs失活。但实际上,氯在DWDS中会不可避免地发生衰减,导致DWDS内余氯含量通常不能有效控制ARB/ARGs的赋存与生长。且研究人员对氯化过程中ARGs丰度的改变原因进行探究,发现DWDS内余氯驱动微生物群落结构改变,这使得DWDS内细菌具有更高的抗生素抗性。进一步研究发现,DWDS中耐氯菌Pseudomonas和Acidovorax会携带持久性ARGs,如多重ARGs(RND转运系统)和杆菌肽ARGs(bacA),这是造成ARGs增加的主要原因。此外,氯消毒可以提高致病菌中ARGs的相对丰度,且单个ARG对氯胁迫敏感,同时氯化可以通过增加细胞通透性促进ARG转移。
消毒剂(如氯、氯胺)往往还可与水中有机物及其前体物反应产生消毒副产物(disinfection by-products, DBPs)。近些年,研究人员发现致突变DBPs会诱导细菌产生抗性,其原理是这些DBPs会使细菌产生基因突变,当突变为抗性突变时,细菌即获得了可遗传的抗性。如吕露等选取3种典型DBPs对病原微生物P.aeruginosa与E.coli进行诱导,继而观察它们对于5种抗生素的响应,结果显示菌株单一抗性提高1.48～12.01倍,多重抗性提高1.55倍。Li等也观察到同样的情况,DBPs的存在使得E.coli对环丙沙星的抗性提高数倍。Lü等进一步对机理进行阐述,外排泵的过量表达是P.aeruginosa对单个和多种抗生素的耐药性增加的主要原因。同时对ARGs进行测序和分析,证实了该效应的机制是突变。此外,同样的诱导现象也出现在E.coli中,这表明DBPs对抗性的影响具有普适性。
2.3细菌生长方式
DWDS中的细菌既可以游离形式存在,也可以管壁生物膜形式生长。有关研究显示,氯化处理过程中磺胺嘧啶、环丙沙星和磺胺嘧啶/环丙沙星的促进,能够使附着于细菌尤其是ARB中胞外聚合物含量增加,胞外聚合物具有较高蛋白质含量和二级结构β-折叠,会导致更多的细菌聚集和吸附,从而有利于DWDS生物膜的形成。实际上,DWDS生物膜广泛地分布于饮用水系统中,而抗生素抗性作为由抗生素或其他化学物质(如消毒剂)触发而产生的适应性反应,相比游离细菌,其在生物膜中具有更高的抗性水平。
生物膜作为DWDS中抗生素抗药性的储存库,主要通过以下几种方式增强其抗性：
(1)生物膜的形成有利于微生物的附着生长,对强吸附性ARB而言提供了良好的生长环境,增强其在DWDS内的持久性；
(2)为抗生素提供屏障,减少外界环境的干扰；
(3)促进微生物之间遗传物质的交换。
有报道称,生物膜中S.aureus的结合转移频率比游离状态高10000倍。同样,研究人员对实际DWDS中的具有四环素、磺胺甲恶唑、克林霉素、诺氟沙星抗性的ARB进行为期一年的测定,其中ARB的分布情况如下：生物膜>出水>进水。
当生物膜的生长和积累到一定程度时,会影响管壁状况,造成管道堵塞、金属管道腐蚀加剧以及水质色度与嗅度的改变。此时若水力条件发生变化,生物膜可能会从管道表面脱落,包括ARB在内的细菌会从生物膜转移到主体水中,从而导致水质恶化。由此可见,生物膜中ARB/ARGs的赋存被认为是威胁饮用水安全的重要因素。
三、DWDS中ARB/ARGs的控制
近年来,人们对于安全饮水意识的提升使其对水质也提出了更高的要求。而一旦ARB/ARGs通过饮水进入人体,将会影响有关抗生素的治疗效果,更甚者会产生无药可用的情况。因此,对管网内ARB/ARGs的管控势在必行,且可以下3个方面进行。
3.1增加深度处理
增加深度处理工艺,减少出厂水中ARB/ARGs的含量,对控制ARB/ARGs在DWDS内的分布至关重要。高级氧化技术被认为是提高饮用水中ARB/ARGs去除的有效手段。Zhang等发现UV/Cl处理在1 min内完全灭活Pseudomonas.HLS-6,而单独UV照射在1 min内仅可降低4log,5 min内才能够完全灭活。且经UV/Cl处理60 min后,sul 1和intI 1分别减少了至少3.50log ARGs和4.00log ARGs。此外,有研究人员尝试用UV-A/TiO2技术去除医疗废水中的典型抗性菌,结果显示TiO2剂量的增加会降低细菌的存活,催化过程将细菌数量减少了3log,但对部分抗性菌如MRSA的去除并不明显。李树铭等对比了O3、UV和UV/O3消毒对4种ARB(Enterococcus、Brevibacillus、Pseudomonas、E.coli)以及4 种ARGs(tetA、blaTEM、sulI和strB)的去除,结果显示ARB均得到了很好的削减,UV/O3会破坏细胞结构且不会导致光复活问题。而Fenton技术去除污水厂二级出水中ARGs过程中也可达到一定的效果,当pH值为3、Fe2+/H2O2摩尔比为1∶10的条件下,反应2 h,ARGs可降低2.58log～3.78log。除此之外,Breazeal等发现有胶体存在时微滤与超滤能够对ARGs进行截留。但Pruden等认为携带ARGs的可移动遗传因子能够透过超滤膜的孔隙,而不能对其进行有效的控制。可见,目前膜过滤技术对于ARB/ARGs的去除具有不稳定性。
3.2调控细菌生长
研究表明,约有95%的细菌附着于生物膜生长。但相比去除成熟生物膜中的ARB/ARGs,控制管网内生物膜的生长是更为有效的措施。实际上,影响生物膜生长的因素很多,包括水中营养物质浓度、管道材质、流速和群体感应等。
DWDS中的微生物大多是以有机物为营养基质的异养型细菌,控制水质中TOC,尤其是可同化有机碳(assimilable organic carbon,AOC)的含量,可减少生物膜在DWDS内的生长。Kooij等提出当DWDS中没有消毒剂残留时,AOC质量浓度低于10 μg/L可以使限制异养菌的生长。而Lechevallier等则认为当存在大于0.5 mg/L的游离氯或1.0 mg/L的氯胺时,AOC质量浓度应低于50 μg/L或100 μg/L才可抑制细菌的再生。此外,DWDS的材料也会影响生物膜的生长速率。李爽等在镀锌钢管跟PVC管中模拟DWDS中生物膜的生长过程,6个月后,就生物量而言镀锌钢管比PVC管中高出一个数量级,这是由于粗糙的表面加快了DWDS内的腐蚀使得微生物易于附着,在分泌的胞外聚合物作用下,会黏附更多的细菌以及营养物质,逐渐形成生物膜。12个月后,两种管材内的生物量趋于稳定,此后管道材质对于生物膜的影响减少。因此,定期更新DWDS中的管段可以有效阻止生物膜的发育。流速也是影响DWDS中生物膜生长的重要因素,更高的流速会促进使DWDS内微生物分泌更多的胞外聚合物,从而有利于更加密实的生物膜形成。这也从另一方面证实冲洗并不是去除DWDS内生物膜的有效途径。群体感应是细菌间的一种交流机制,细菌向外界释放信号分子,当浓度达到特定阙值时,会诱导细菌中特异性基因的表达反过来调节细菌间的行为方式。Wu等通过投加不同浓度酰基高丝氨酸环内酯类物质(acy-l homoserine lactone,AHL),发现在一定范围内AHL可通过增加饮用水中相关菌株的生物量进而促进生物膜的形成。目前,实验室条件下已成功通过投加天然的群体感应抑制剂,阻碍了活性炭表面生物膜的生长。
3.3优化消毒方式
传统消毒工艺对DWDS内ARB/ARGs去除有一定的局限性。研究显示,低氯剂量时(40 mg/L),细菌转移接合效率增大了2～5倍。为此,优化消毒方式势在必行。正如前文所述,DBPs与ARB的产生联系紧密,减少DBPs的产生有利于降低ARB的含量。为此,陈超开发了一种短时游离氯(<15 min)后转氯胺顺序氯化消毒工艺,经实验室模拟以及中试调试,显示相比传统消毒,此消毒工艺能够减少35.8%～77.0%的三卤甲烷以及36.6%～54.8%的卤乙酸产生量。此外,纪瑶瑶等探究了顺序氯化工艺对原水进行处理的最优反应条件,结果表明在加氨转化时间为30 min时,经消毒处理24 h后,3种N-DBPs的前体物产量减少72%～82%。
四、总结与展望
目前,DWDS内ARB/ARGs富集现象已引起人们的广泛关注。与常规工艺相比,先进的处理工艺对ARB/ARGs去除虽起到了一定的控制作用,但价格成本昂贵。我国作为抗生素使用大国,在建立医疗、畜牧等相关行业的管控策略从根本上减少源头输入的同时,未来应从以下几个方面进行相关研究：
(1)阐明DWDS内细菌尤其是病原微生物中ARGs的富集与传播机制;
(2)寻求低成本减少ARB/ARGs的方法,开发新型技术在降低成本的同时能够针对性地去除DWDS内的ARGs;
(3)科学评估饮用水中与ARB/ARGs暴露相关的人体健康风险,可以此为依据建立对ARB/ARGs管控标准。
