香港大学张彤教授STOTEN：污水中新冠病毒检测方法评估
新型冠状病毒 (SARS-CoV-2, 简称新冠病毒)爆发后，检测分析污水中的新冠病毒，可为医学测试提供重要的辅助资料，包括提供疫情预警信号、追踪社区疫情发展和发现社区隐形个案等。不同于临床样品，污水样品新冠病毒RNA因受社区人群影响而被高度稀释，因此，在检测之前需要先进行病毒浓缩。本文评估了十一种不同的方法流程对污水中新冠病毒检测效果的影响，包括八种小体积方法的比较，大体积与小体积方法的比较，以及两种不同提取方法的比较。
图文摘要 | Graphical abstract
导读 | Introduction
新型冠状病毒 (SARS-CoV-2, 简称新冠病毒)爆发后，检测分析污水中的新冠病毒，可为医学测试提供重要的辅助资料，包括提供疫情预警信号、追踪社区疫情发展和发现社区隐形个案等。不同于临床样品，污水样品新冠病毒RNA因受社区人群影响而被高度稀释，因此，在检测之前需要先进行病毒浓缩。本文评估了十一种不同的方法流程对污水中新冠病毒检测效果的影响，包括八种小体积方法的比较，大体积与小体积方法的比较，以及两种不同提取方法的比较。
八种小体积方法的比较
Comparisons of eight concentration methods using a small starting volume
将采集的污水样品灭活后，加入灭活的SARS-CoV-2病毒用于方法评估。对于小体积样品，评估了基于四种不同方法原理的八种方法流程。结果发现，超速离心法表现出最高的回收率 (25.4 ± 5.9%)，且显著高于其他的方法原理 (p < 0.01)，其次为沉淀法和离心超滤法，最后为膜吸附-洗脱法(图1)。
图1 八种小体积方法的比较。(a)Ct值 (b)回收率UC: 超速离心法( 150,000 × g， 60分钟);AlCl3: AlCl3 絮凝沉淀法 (1%, 0.3M, v/v);PEG: PEG沉淀法 (10% PEG, w/v, 及2% NaCl, w/v);MgCl2: MgCl2沉淀法 (1%, 2.5M, v/v);A15：离心超滤法 (使用分子当量为10 kDa的Amicon-Ultra 15 Centrifugal Filter);C70：离心超滤法 (使用分子当量为30 kDa的Centricon Plus-70 Centrifugal Filter);AlM：膜吸附-洗脱法(添加AlCl3后使用0.45 μm 的负电荷滤膜进行吸附-洗脱);MgM：膜吸附-洗脱法(添加MgCl2后使用0.45 μm 的负电荷滤膜进行吸附-洗脱)。
大体积和小体积方法的比较
Comparisons of large-volume and small-volume concentration methods
为探讨使用更大污水体积(1000 mL)对提高方法灵敏性的可能，本文将三种大体积方法与最优的小体积方法(超速离心法)进行了比较。在加标SARS-CoV-2的污水样品中，虽然大体积超速离心法的灵敏性优于另外两种大体积方法(AlCl3沉淀法和膜吸附法)，但也只是达到与小体积超速离心法相近的灵敏性。在加标SARS-CoV-2而处于临界值浓度的污水样品中，大体积和小体积方法均能达到同样的检测范围。在35个未加标的真实污水样品中，大体积和小体积超速离心法表现出一样的检出率，大体积方法的Ct值略低于小体积方法 (0.67 Ct)。该结果表明，增大污水体积并不能显著提高方法灵敏性，可能是由于污水的基质效应在大体积方法中被同步浓缩，不利于后续的RNA提取与检测。
图2 大体积和小体积方法的比较。（a）三种大体积方法和最优小体积方法的Ct值比较；（b）基于35个未加标的真实污水样品的大体积和小体积超速离心法的Ct值比较。
Large-UC: 大体积超速离心法 （20,000 × g离心30分钟，再150,000 × g超速离心60分钟）；AlCl3: AlCl3 絮凝沉淀法 （1%, 0.3M, v/v）；Membrane：膜吸附-洗脱法（使用0.45 μm 的负电荷滤膜进行吸附-脱附）；Small-UC: 小体积超速离心法 （150,000 × g超速离心60分钟）。
表1 加标SARS-CoV-2而处于临界浓度的污水样品和未加标的真实污水样品的检出率和Ct值。
两种提取方法的比较
Comparisons of two extraction methods
采用小体积超速离心法对污水样品浓缩，通过比较两种不同的RNA提取方法。结果表明，在加标SARS-CoV-2到不同基质效应的污水样品中，QIAamp Viral RNA Kit（简称Viral Kit）比TRIzol Plus RNA Purification Kit（简称TRIzol Kit）能够检测到更低Ct值（图3a）；在加标SARS-CoV-2而处于临界值浓度的污水样品中，Viral Kit检测浓度范围能达到低浓度样品，而TRIzol Kit只能达到中浓度样品（表1，图3b）。在PBS（生理盐水）或污水梯度稀释的样品中，Viral Kit比TRIzol Kit表现出更高的提取效率（图3c 和图3d）。该结果表明，Viral Kit表现优于TRIzol Kit，但两者均有较好的提取效果。
图3 两种提取方法的比较。（a）加标SARS-CoV-2到不同基质效应的污水样品的Ct值比较；（b）基于31个未加标真实样品的Ct值比较；（c）用PBS梯度稀释加标样品的Ct值比较；（d）用污水梯度稀释加标样品的Ct值比较。
总结 | Conclucions
本文以加标SARS-CoV-2的污水样品和未加标的真实污水样品为研究对象，评估了十一种不同的新冠病毒检测方法，包括不同的方法原理，不同的污水体积和不同的提取方法。总体而言，小体积超速离心法结合病毒裂解液法的Viral Kit进行RNA提取能够实现对污水中SARS-CoV-2病毒的快速而灵敏检测。本研究结果为应用已有的或新开发的SARS-CoV-2污水检测方法提供了数据支撑和参考依据。
