污水厂再生水中耐氯大肠杆菌筛查及细菌耐药性分析
为研究再生水回用过程中的生物安全风险，对两座城镇污水处理厂再生水样品中人源微生物污染、耐氯大肠杆菌分布及细菌耐药性情况进行调查分析。结果显示，85.7%的再生水样品存在人源微生物污染风险；再生水中共分离到8株耐氯大肠杆菌，占所分离大肠杆菌的20% (8/40)，为我国首次报道该菌存在，该菌的出现对水处理过程中微生物的有效消杀提出了挑战；50%(20/40)的大肠杆菌至少耐受一种抗生素，10%耐受至少3中抗生素，3株大肠杆菌呈ESBL阳性，说明再生水具有耐药性细菌传播风险。因此，污水处理厂应优化处理工艺，提高对耐氯菌的消杀水平，并通过多部门联合治理以控制耐药菌传播，提高再生水的生物安全性。
污水再生回用是缓解水资源短缺的有效途径，目前再生水已被用于城市景观、农田灌溉、地下水回灌、工业冷却水、洗车等。然而再生水中可能含有多种病原微生物（如病毒、细菌、寄生虫等），因此保障再生水的生物安全性至关重要。
再生水生产工艺包含多种微生物去除手段，其中物理手段包括膜过滤、紫外线，化学手段主要包括加氯消毒及臭氧消毒。氯消毒方式应用较为广泛，它主要利用次氯酸（HClO）和二氧化氯（ClO2）的氧化特性，破坏微生物体内的蛋白质、DNA和RNA等，达到杀菌效果。Zhi等人的前期研究发现污水中存在高耐氯菌，这类菌株还携带耐热基因，具有很强的耐热性，同时携带特异性DNA标记uspc-IS30-flhDC。这些耐氯菌株的出现将降低氯消毒的杀菌效果，威胁再生水的生物安全性。
再生水中细菌耐药性问题也是目前关注热点。污水中含有大量的微生物，为基因水平转移（HGT）提供了良好环境。通过HGT，抗性基因可传递到某些致病菌中，反之毒力基因也可传递到抗性菌中，促进了抗性致病菌的出现。研究发现，氯消毒可提高污水所含抗生素基因含量这些都对再生水的微生物安全造成巨大挑战，若处理不当则可成为耐药菌传播的源头。为此，以宁波市两家污水处理厂的再生水为例，调查其进水及再生水中是否存在耐氯大肠杆菌，并测定再生水中大肠杆菌的耐药性，了解细菌耐药情况。
01 水样来源及处理工艺
选取宁波市两座污水处理厂(A厂和B厂)，采集进水及再生水水样。两厂进水主要为生活污水，A厂采用高效沉淀池+滤布滤池工艺，经紫外消毒后回用，B厂采用MBR+D型滤池工艺，经紫外消毒后回用。
02 结果
2.1 再生水厂日常检测指标
为保障再生水回用安全，我国已出台相关标准，对再生水用于农田灌溉、景观环境、工业及城市杂用（如冲厕、消防、车辆冲洗等）作了规定。A、B两座污水处理厂所产再生水的常规水质指标如表1所示，均达到了《城市污水再生利用 景观环境用水水质》（GB/T 18921—2019）要求。
由表1可知，两厂所产再生水中的粪大肠菌群指标远小于农业灌溉用水、景观用水、工业用水的限值要求。因此从生物安全性角度，其不仅可用于河道补给，还可拓展应用于农业、工业及景观用水。然而《城市污水再生利用 城市杂用水水质》中要求大肠杆菌不能检出，因此目前两厂所产再生水不能直接用于冲厕、车辆冲洗、城市绿化、道路清扫、消防、建筑施工等城市杂用。
2.2 进出水人源微生物污染检出率
经测定，所有进水样品均检出人源微生物污染HF183分子标记，即检出率为100%。14个再生水样品中共有12个检出人源微生物污染HF183分子标记，即检出率为85.7%，其中A厂检出率为100%，B厂检出率为71.4%，表明两厂再生水中存在人源微生物污染可能性。
2.3 再生水厂进出水耐氯菌的检出率
14个污水处理厂进水水样共有7份样品检出耐氯大肠杆菌uspc-IS30-flhDC分子标记，检出率为50%，其中A厂检出率为42.9%（3/7），B厂检出率为57.1%（4/7）。14份再生水样品中共有2份检测出含有耐氯大肠杆菌uspc-IS30-flhDC分子标记，检出率为14.3%，其中A厂和B厂的检出率均为14.3%。
A厂7份再生水样品中仅有3份样品有菌落生长，但菌落特征显示全部为非粪大肠菌群菌落。B厂7份样品全部长出粪大肠菌群菌落，通过分离鉴定共获得40株大肠杆菌，其中耐氯大肠杆菌8株。耐氯菌株来自6份再生水样品，因此再生水耐氯大肠杆菌总检出率为42.9%（6/14），6份样品全部来自B厂，B厂的耐氯大肠杆菌总检出率为85.7%（6/7）。该结果表明， A厂所产再生水具有较高的生物安全性。然而在采样期间B厂加氯设备未运行，仅使用紫外一种消毒方式，工艺流程的差异可能导致了A厂所产再生水水质优于B厂，未能从A厂再生水样品中分离到大肠杆菌。
两厂14份再生水样品DNA中仅有2份含耐氯大肠杆菌uspc-IS30-flhDC分子标记，然而，通过对相同14份再生水样品过滤膜并在MFC培养基选择性培养粪大肠菌群后，共从6份样品中分离得到耐氯大肠杆菌。导致出现上述差异的原因可能是在对样品进行选择性培养后，大肠杆菌数量大量增加，因此分离得到耐氯大肠杆菌的概率增大。该结果提示可通过对样品前处理，增加选择性培养步骤，提高耐氯菌的分离率。
2.4 再生水中大肠杆菌耐药性
本研究所分离40株大肠杆菌对氨苄西林的耐药率最高为40%，其次为复方磺胺(20%)、环丙沙星(15%)、ESBL(7.5%)、阿莫西林/克拉维酸(7.5%)、头孢曲松(7.5%)、头孢西丁(5%)、氨曲南(5%)、左旋氧氟沙星(5%)、庆大霉素(2.5%)、呋喃妥因(2.5%)，见表2。分离得到的大肠杆菌50%至少耐受1种抗生素，5株菌耐受2种抗生素，耐受4种和5种抗生素的菌株各1株，耐受8种抗生素的菌株共2株。40株大肠杆菌中的8株耐氯菌，仅有2株对氨苄西林耐受，1株对复方磺胺耐受，其余5株对所有抗生素敏感。
03 讨论
近年来，随着城市人口剧增和经济快速发展，全球水资源严重不足。与此同时，全球变暖导致的极端气候频发愈发加剧了水资源短缺。再生水作为缓解水危机的重要途径之一，不仅可用于工农业生产及市政杂用，在国外某些缺水地区甚至已尝试将再生水用作生活饮用水间接补充水源。然而再生水水源含有大量污染物，因此在其回用过程中不仅存在化学性危害风险，其所携带的病原微生物对人类的生物安全性风险也不容忽视。
研究发现，在A厂一些再生水样品中未能检测到粪大肠菌群，然而这些样品均含有人源微生物污染标记物HF183，存在携带致病微生物风险，说明仅检测粪大肠菌群不能对再生水安全性进行准确评估。Harwood等人的研究也显示仅使用个别肠道指示菌（如总大肠菌群、粪大肠菌群、粪肠球菌等）无法准确反映再生水中致病微生物情况。目前我国多项国家标准将检测粪大肠菌群作为再生水生物安全性评价唯一手段，急需引入其他检测方法，提高再生水生物安全评估技术水平。随着测序技术及生物信息学的发展，使用宏基因组技术对样品中所有微生物进行检测，在经济和技术层面的实施性已完全具备。宏基因组技术通过测定样品中全部核酸序列，可对样品中所有微生物的种类及丰度进行鉴定。因此可将宏基因组技术应用到再生水回用领域，实现对其生物安全性的全面精确评估。
为保障出水生物安全性，污水处理厂水质净化过程需包括消毒处理，加入氯消毒剂为最常用消毒手段。目前我国氯消毒剂使用量非常巨大，那么在氯消毒剂的巨量使用所提供的强大进化选择压力下，是否会出现耐氯处理致病微生物？大量研究证明，当暴露于有害环境因素后，细菌基因组的高可塑性，使其可进化出抵御机制来保障自身正常生存繁殖，例如细菌的耐抗生素、耐重金属、耐热性等特性便可通过基因突变或获取外源抗性基因获得。因此大量的氯暴露，必然导致耐氯菌的出现。作者前期研究便发现一些大肠杆菌更适应在污水中生存，这些大肠杆菌对氯的抗性高达标准菌株的100倍，并携带一个特异性DNA标记uspC-IS30-flhDC。目前已在加拿大、瑞士、美国污水中发现该类耐氯大肠杆菌。本研究中，B厂7份样品耐氯大肠杆菌检出率达85.7%（6/7），说明本地污水系统中存在耐氯大肠杆菌，为首次在我国报道此菌，说明该菌已在全世界范围流行。该菌株的耐氯性和耐热性分别为普通菌株的100倍和100万倍，更易逃过消毒处理，对水处理效率造成挑战。同时细菌耐氯性与其感染宿主的能力呈正相关，因此该类菌可能更容易突破人体免疫防御系统，危害人类健康，危及再生水生物安全。
本研究并未从A厂分离到耐氯大肠杆菌。A厂使用氯消毒及紫外消毒两种消毒方式，而B厂在采样期间仅使用紫外消毒，因此B厂再生水中大肠杆菌含量相对较高，提高了分离到耐氯大肠杆菌的几率。尽管耐氯大肠杆菌可降低氯消毒效力，本研究显示A厂所使用的紫外线+氯消毒工艺仍可对其有效去除。多项研究证明，采用联合消毒工艺，如氯消毒+紫外消毒，可通过弥补各自工艺不足，提高对病毒、细菌芽孢、寄生虫的杀灭效果。因此为保障再生水生物安全性，建议联用多种消毒工艺，以提高消毒效果。
污水中含有大量微生物，是细菌耐药性传播的重要场所。研究发现，处理后污水排入环境后，可导致下游水体耐药基因浓度升高。因此再生水回用过程中，需关注其耐药基因携带情况，防止再生水成为耐药基因传播媒介。Blaak等人发现污水厂出水中69%大肠杆菌菌株对所测8种抗生素敏感，而Craddock等发现某再生水系统出水中71.4%的菌株对所测24种抗生素敏感。本研究所分离大肠杆菌中50%对所有21种抗生素敏感，但仅有10%菌株耐受3种以上抗生素，因此宁波市再生水中细菌耐药性问题尚不突出。然而，本研究共分离到3株产ESBL大肠杆菌，ESBL可使菌株耐受多种β-内酰胺类抗生素，包括第三代头孢菌素和单酰胺环类抗生素，且ESBL菌株常同时耐受其他类抗生素。产ESBL菌株目前在全世界流行性不断上升，相关部门应当给予高度重视，加强临床治疗及养殖中抗生素使用的监管，控制耐药菌产生和传播。同时再生水回用中也需关注此类菌株的存在情况，研究开发新型杀菌技术，降低其通过再生水传播感染人类风险。
04 结论
宁波两座污水处理厂所产再生水符合国家再生水回用河道标准，从再生水中共分离到8株耐氯大肠杆菌，在我国尚属首次报道。该菌的出现对水处理过程微生物的有效消杀提出了挑战，水务部门需优化处理工艺，提高消毒水平。同时，分离到多株耐药大肠杆菌，其中包含耐ESBL菌株，它们的出现会威胁再生水回用中的生物安全，相关部门应对细菌耐药性进行联合治理，从源头控制耐药菌的产生，从传播链控制耐药菌的扩散，保障人类健康。
