新型生物质碳源强化脱氮效果及微生物菌群分析
研究背景
随着我国日益严格的地方排放标准相继实施，要求出水TN指标低于10 mg/L，大多数城镇污水处理厂为了保证出水TN能够稳定达标，通常采取外加碳源以强化反硝化脱氮，如甲醇、葡萄糖、乙酸钠、复合碳源等传统化工碳源，但存在安全性差、价格过高等问题。
生物质废弃物及其衍生物因廉价易得可以作为资资源化循环利用引起了研究人员的广泛关注。生物质废弃物通过热裂解处理，提炼或制造生物质能源、生物质肥料和生物质环境材料等各种生物质资源物质，可以实现全球每年约10亿t CO2当量的减排潜力。其中利用生物质废弃物制造生物质能源过程中会有大量的衍生物粗甘油产生，该粗甘油主要成分为甘油，占比达40%以上，此外还含有部分长链烷烃、醛类和苯酚类等物质，外观呈深棕色粘稠状液体，具有无毒、安全、稳定等特点。
近年来，以甘油作为污水处理外加碳源的研究已成为热点。夏雪等采用甘油作为反硝化除磷的碳源，除磷效率高达 79.2%。彭志英等采用粗甘油生物质碳源对活性污泥进行驯化研究后，其反硝化潜力升高至10.63 mgNO3--N/( gVSS·h)。胡明明等采用甘油作为碳源的地下水硝酸盐氮去除试验中, 投加反硝化菌种可以高效的去除硝酸盐氮, 去除率可以达到97.7%以上。研究结果表明，甘油作为污水处理脱氮除磷的生物质碳源，可以强化微生物脱氮除磷潜力。基于安全性和经济性等方面的考虑，以生物质废弃物及其衍生物粗甘油作为生物质碳源的主要原料，不仅价格低廉、来源广泛，生物降解性能好，而且也为生物质废弃物资源化利用提供有效的路径。
尽管生物质废弃物及其衍生物粗甘油作为反硝化过程碳源的研究较多，但实际工程应用案例较少。为切实提高生物质碳源作为传统碳源替代物在污水处理厂应用的可行性，本研究采用以粗甘油作为主要原料的生物质碳源，在太湖流域某城镇污水处理厂进行工程应用，进行强化生物反硝化脱氮效能的试验，同时结合分子生物学技术，对微生物群落进行解析，探究生物质碳源对污水处理反硝化脱氮效能与菌群变化的影响，以期为污水处理厂生物脱氮外加碳源提供新的选择，同时还可以间接降低二氧化碳排放，从而实现碳中和目标发挥作用。
摘要
为了实现城镇污水处理厂深度脱氮效果，以太湖流域某污水处理厂为对象，采用以生物质废弃物再利用过程中产生的衍生物甘油为主要原料的生物质碳源作为反硝化电子供体，分别研究了缺氧池、深床滤池的反硝化脱氮效果，同时解析了外加生物质碳源前后的微生物群落结构变化特征。结果表明，生物质碳源在缺氧池每天投加2.5~3.0 t/d时，可使缺氧池硝态氮浓度下降1.67~1.73 mg/L，去除率约52%~68%；深床滤池在投加生物质碳源后反硝化脱氮过程中每去除1 mgNO3--N约消耗5.27 mgCOD，进而使得出水TN能够达到5 mg/L以下，实现了出水TN的稳定达标排放。通过16S rRNA基因序列分析发现，缺氧池和深床滤池微生物优势菌门主要为Proteobacteria、Actinobacteriota、Chloroflexi 和Bacteroidota。深床滤池由于工艺条件和生长环境不同，在投加生物质碳源后Thiothrix、Bacillus、Propionicicella、norank_f__Rhodocyclaceae、Terrimonas等具有反硝化脱氮功能的优势菌群较为突出，有效保证了系统稳定的深度脱氮效果，同时间接降低二氧化碳排放，对碳减排及“碳中和”有积极贡献。
01、试验设计与方法
1. 试验材料
本研究在太湖流域某城镇污水处理厂进行，该污水处理厂运行规模为15万m³/d，其中一期工程规模4万m³/d，采用改良AAO工艺，深度处理单元采用V型滤池工艺；二期工程规模为11万m³/d，采用改良AAO工艺，深度处理采用深床滤池工艺。具体进、出水水质见表1所示，其中出水水质COD、TN、氨氮、TP指标满足《太湖地区城镇污水处理厂及重点工业行业主要水污染排放限值》（DB32/1072 —2018）一、二级保护区的排放限值要求，出水水质BOD5、SS指标满足一级A（GB18918-2002）排放标准。
表1 太湖流域某城镇污水处理厂设计进、出水水质
生物质碳源由某碳源生产企业提供，原材料主要来源于生物质能源制作过程中产生的衍生物粗甘油，COD当量约20万mg/L。
2. 试验设计
自2021年9月3日至2021年9月21日开展为期19天试验，试验期间污水处理厂进水主要水质指标COD浓度约210 mg/L；试验地点分别为一期1#、2#缺氧池以及二期深床滤池；其中一期1#、2#池外回流R为100%，内回流r为300%-400%（9月3日—9月6日为300%；9月6日—9月21日为400%）。
一期缺氧池投加点位于缺氧池内回流与进水混合后的位置，此处DO浓度约0.3 mg/L；二期深床滤池投加点位于深床滤池进水处的位置。每天记录进出水NO3--N浓度、生物质碳源投加量、进水实时流量、溶解氧等参数。。
3. 分析项目及方法
COD、NO3--N指标采用标准方法测定，DO采用德国WTW多参数水质分析仪Multi 3430测定。
4. 分子生物学分析方法
为了研究生物质碳源投加前后缺氧池和深床滤池微生物多样性及其群落结构变化，对缺氧池和深床滤池的污泥样品进行DNA提取，定量PCR和高通量测序分析。其中SH-1表示一期缺氧池生物质碳源投加前微生物；SH表示一期缺氧池生物质碳源投加后微生物；LC-1表示二期深床滤池生物质碳源投加前微生物；LC表示二期深床滤池生物质碳源投加后微生物。Miseq建库及基因测序委托上海晶能生物技术有限公司进行，DNA序列测序数据、质量控制、序列拼接及生物信息高级分析由该公司协助完成。
02、结果与讨论
1. 缺氧池生物质碳源投加试验
为期19 d的缺氧池（1#、2#）生物质碳源投加试验如图1所示。由图1（a）可知，1#缺氧池进水NO3--N浓度在1.48-7.38 mg/L范围之间，均值约3.83 mg/L，出水NO3--N浓度在0.15-5.39 mg/L，均值约2.16 mg/L，NO3--N浓度下降约1.67 mg/L，去除率维持在52%左右。在第一天还未投加生物质碳源时，1#缺氧池进、出水NO3--N浓度分别为2.07 mg/L、0.83 mg/L，NO3--N浓度下降1.24 mg/L，表明缺氧池存在一定的反硝化脱氮效果，主要原因是进入缺氧池的原水中含有部分碳源，为缺氧池反硝化菌提供脱氮所需的电子供体。第二天生物质碳源开始投加，缺氧池进、出水NO3--N下降仅1.01 mg/L，与第一天未投加碳源的反硝化效果相比并没有明显的改善。随着试验持续开展和生物质碳源投加量逐渐增加，缺氧池反硝化脱氮效果明显，NO3--N下降量提升至1.78 mg/L左右。2#缺氧池在投加生物质碳源后变化规律与1#缺氧池相同。由图1（b）可知，进水NO3--N浓度在1.48-6.85 mg/L范围之间，均值约2.78 mg/L，出水NO3--N在0.12-4.48 mg/L，均值低至1.05 mg/L，下降约1.73 mg/L，去除率维持在68%左右。从工程试验结果来看，以粗甘油为主要原料的生物质碳源投加在城镇污水处理厂缺氧池中，具有强化反硝化脱氮性能特性。
图1 一期缺氧池进出水重要指标变化（a）1#缺氧池；（b）2#缺氧池
2. 深床滤池生物质碳源投加试验
为期19 d的深床滤池生物质碳源投加试验如图2所示。由图2（a）可知，在生物质碳源投加试验第一天时深床滤池进、出水NO3--N浓度分别为3.66、3.65 mg/L，基本没有发生反硝化脱氮作用，主要原因是某污水处理厂深床滤池在实际运行过程中不外加碳源，造成反硝化脱氮过程缺少电子供体碳源。在生物质碳源持续投加的第二天，深床滤池进、出水NO3--N浓度分别为6.12、3.97 mg/L，NO3--N浓度下降2.15 mg/L，出现明显的反硝化脱氮效果，由此说明生物质碳源能够强化深床滤池反硝化脱氮过程，提高污水脱氮效果。随着工程试验的进行和生物质碳源投加量的增大，深床滤池反硝化脱氮效果逐渐得到改善，进、出水NO3--N浓度去除率稳定在48.66%左右。另外，由于二沉池出水存在明显的跌水复氧过程，造成进入深床滤池的污水携带大量DO，由图2（b）可知，深床滤池的进水DO浓度在5.89-7.08 mg/L范围之间，均值约6.58 mg/L，在投加生物质碳源后，深床滤池出水DO浓度逐渐下降，最低浓度低至0.42 mg/L，说明深床滤池滤料上附着的微生物含有好氧的异养菌，在降解有机物过程中消耗了大量DO，这在运行过程中虽然会造成生物质碳源的无效浪费，但也改善了深床滤池反硝化脱氮的缺氧环境，降低DO对反硝化作用的抑制效果。
a-NO3--N浓度 b-DO浓度
图2 深床滤池进出水重要指标变化
表3为深床滤池生物质碳源消耗量及反硝化脱氮比值变化。由于深床滤池进水携带大量DO，这部分DO会消耗生物质碳源。根据相关文献资料可知，每1 mg DO需要消耗0.87 mg COD，通过核算这部分DO每天大约浪费2.7 t/d生物质碳源（20万当量）。扣除这部分损耗浪费，深床滤池每去除1 mg NO3--N大约实际需要消耗5.27 mg COD，这一结论与理论值基本一致。
图3 深床滤池生物质碳源消耗量及反硝化脱氮比值变化
3. 微生物群落分析
1）多样性指数分析。
投加生物质碳源对微生物多样性有一定的影响。如表2所示，投加生物质碳源后深床滤池Shannon值显著变大、Simpson值显著变小，表明投加碳源后深床滤池滤料上附着的微生物多样性明显上升，主要原因是深床滤池投加生物质碳源改变了深床滤池构筑物功能，由原来单一的去除悬浮物功能单元变成了具有反硝化脱氮性能功能单元，改变了滤料上附着的微生物生存环境，使滤料上适应且喜好碳源环境的微生物功能菌种逐渐被富集，有效改善了深床滤池反硝化脱氮效果。而投加生物质碳源钱后的缺氧池Shannon、Simpson值几乎没有变化，但Shannon值高达5.4、Simpson值接近于0，说明缺氧池微生物多样性非常高，原因主要在于某污水处理厂污水处理工艺为改良AAO工艺，活性污泥微生物在缺氧、厌氧、好氧等环境下交替运行，生存环境更加复杂。Beta 多样性表示样品之间的群落差异性。投加麦可碳前后缺氧池和深床滤池中微生物群落结构的差异情况如图4，结果表明生物质碳源投加后，缺氧池中活性污泥的群落结构差异相对较小，而深床滤池中活性污泥的群落结构差异明显。
表2 Alpha多样性指数表
图4 微生物Beta多样性PCoA分析
2）微生物群落结构分析。
进一步对不同样品的门和属水平上的微生物群落组成进行分析。门水平群落结构变化显示如图5，在四组样品均以变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteriota、Chloroflexi 和拟杆菌门Bacteroidota作为主要菌群。Proteobacteria 往往是活性污泥系统中最常见的和丰度最高的优势菌，然后是 Bacteroidetes、Chloroflexi、Actinobacteria、浮霉菌门Planctomycetes和 Firmicutes，它们在不同水质条件下的占比各不相同。Proteobacteria 在污水处理系统中多数为兼性或专性厌氧菌，其中大部分属异养型细菌，是COD和脱氮过程的重要贡献者。变形菌门包含的最主要的纲均为β变形菌纲BetaProteobacteria，其包含较多好氧或兼性细菌，被认为与污泥反硝化作用密切相关。Actinobacteria 在自然界中常扮演分解者角色，Chloroflexi 对复杂有机物和某些聚合物的降解发挥重要作用；可以将死细胞、EPS等降解为如乳酸、乙醇等的简单有机物。Patescibacteria可以广泛参与反硝化过程。Nitrospirota是隶属于亚硝酸盐氧化细菌和完全氨氧化细菌的一个门。深床滤池在投加生物质碳源后，优势菌群变形菌门 Proteobacteria的相对丰度从接种污泥中的54.9%下降到34.0%，而放线菌门Actinobacteriota、绿弯菌门Chloroflexi、Patescibacteria和酸杆菌门Acidobacteriota的丰度均提升至18.4%、15.1%、9.0%和5.2%。缺氧池在投加生物质碳源前后微生物组成变化较小，其中Chloroflexi、硝化菌门Nitrospirota 和厚壁菌门Firmicutes 菌群丰度有小幅度的提升。以上在投加生物质碳源后相对丰度增加的菌群均与含氮和有机物等物质的代谢有关，说明生物质碳源的投加对微生物的群落结构有显著影响，有利于微生物多样性的提升和对含氮及COD等污染物有去除效果的相关微生物的富集。
图5 微生物群落在门水平的组成分析
属水平群落结构变化显示如图6。深床滤池在投加生物质碳源之后微生物群落组成变化较大，缺氧池活性污泥微生物群落组成变化相对较小。投加碳源之后，深床滤池中菌属陶厄氏菌属Thiothrix、Romboutsia、Rhodocyclaceae、norank_f__Saprospiraceae、Nitrospira、Terrimonas、norank_f__Caldilineaceae、Propionicicella的占比均呈现明显的增加现象。缺氧池中的菌属Bacillus、norank_f__Saprospiraceae和norank_f__Caldilineaceae也呈现出一定的增加现象。Bacillus菌属具有异养反硝化和好氧硝化的潜力；Thiothrix为BetaProteobacteria纲下的一类细菌, 革兰氏阴性，多为杆状，具有反硝化能力；Propionicicella有助于硝酸盐的减少；Romboutsia是一种产酸微生物，可以参与复杂有机物的降解。Rhodocyclaceae和 Terrimonas具有反硝化作用，norank_f__Saprospiraceae 的富集可能有利于提供更多的碳源以协助反硝化过程；Nitrospira能够氧化亚硝酸盐，是硝化作用的主要驱动因素；norank_f__Caldilineaceae是一种具有脱硝和多环芳烃去除能力的细菌。在投加麦可碳源后，以上菌种占比的增加均强化了系统中氮等污染物的去除能力。
图6 微生物群落在属水平上的组成分析
3）功能基因预测分析。
基于高通量测序结果对不同样品进行了功能基因预测。如图7所示，FAPROTAX预测结果显示投加生物质碳源前后深床滤池中硝酸盐还原相关基因发生明显变化。深床滤池中投加碳源后与亚硝酸盐反硝化、硝酸盐反硝化、硝酸盐呼吸作用等相关的nitrite denitrification、nitrate denitrification、nitrous oxide denitrification功能基因丰度提高，说明该生物质碳源具有优化微生物菌群结构，促进了系统中的反硝化过程，提高了系统的多样性和抗冲击能力。
图7 基于 FAPROTAX 软件的功能基因预测
03、结论
1）试验期间生物质碳源投加量在2.5-3 t/d之间时（COD当量20万mg/L），缺氧池可去除1.67-1.73 mg/L的硝态氮量，去除率维持在52%-68%左右；深床滤池反硝化脱氮过程中每去除1 mgNO3--N约需要消耗5.27 mgCOD。通过试验可知，该生物质碳源有良好的可生化降解性，所提供的COD被微生物吸收利用率高。
2）缺氧池和深床滤池中含有大量与反硝化作用密切相关的菌群，如Thiothrix、Bacillus、Propionicicella、Rhodocyclaceae、 Terrimonas等。在投加生物质碳源后，深床滤池反硝化脱氮菌属占比有明显增加，丰富度和多样性发生显著变化，其中与亚硝酸盐、硝酸盐反硝化等相关的nitrite denitrification、nitrate denitrification、nitrous oxide denitrification功能基因丰度提高。从菌群分析的角度可知，该生物质碳源具有优化微生物菌群结构，强化反硝化脱氮能力，从而提高系统的抗冲击能力，有效保证系统的脱氮除磷效果。
3）本工程应用采用的生物质碳源来源于生物质废弃物制造生物质能源过程中产生的衍生品，与化石类原料制成的传统碳源相比，具有绿色、安全环保等综合优势，同时还可以间接降低二氧化碳排放，对碳减排及“碳中和”有积极贡献。
